检测APOE基因型别的引物和方法技术

本发明专利技术公开了一种检测与动脉粥样硬化、冠心病等心脑血管疾病和老年性痴呆病有关的基因：ApoE基因型别的引物和方法，所述引物用于扩增基因第4号外显子序列，并采用Sanger测序技术。本发明专利技术可快速地将ApoE基因的编码第112位和第158位氨基酸序列的碱基情况检测出来从而确定其基因型别。利用本发明专利技术完成的检测结果准确，对动脉粥样硬化和老年性痴呆病的早期诊断，并进行个体化治疗具有重要的参考意义。

【技术实现步骤摘要】
检测APOE基因型别的引物和方法
本专利技术属生命科学和生物
，特别涉及检测与动脉粥样硬化和老年性痴呆病有关的APOE基因型别的引物和方法。
技术介绍
载脂蛋白E(ApolipoproteinE，ApoE)为299个氨基酸的蛋白质，分子量34kDa。是一种主要的胆固醇载体，有支持脂质转运和修复脑损伤的功能。ApoE基因位于19号染色体长臂上，全长约3.7kb，有4个外显子，第4外显子表现出基因多态性，使ApoE基因有E2、E3、E43种等位基因，可组合产生6种基因型：三种纯合子(E2/2、E3/3、E4/4)和三种杂合子(E3/2、E4/2、E4/3)。ApoE基因具有异构体特异性，即不同基因编码的蛋白质功能具有差异性，从而导致不同蛋白质对脂质的代谢能力不同、抗氧化及抗炎症能力不同。ApoE的氨基酸序列的第112位和158位两种氨基酸残基即精氨酸(Arg)和半胱氨酸(Cys)的变异决定了其基因型别。ApoE4在这两个位置上都是Arg；ApoE2都是Cys；112位为Cys和158位是Arg者为ApoE3。自然人群中，基因频率E3分布最高，ApoE3/3表型分布占比约70％。阿尔茨海默病(Alzheimer’sdisease，AD)是一种起病隐匿的进行性发展的致死性神经系统退行性疾病。病因迄今未明。65岁以前发病者，称早老性痴呆；65岁以后发病者称老年性痴呆。在美国所有死亡的人群中排第六，估计65岁以上的人大约13％，85岁以上的大约45％有AD。因此，探讨AD发病的危险因素对易感人群的早发现、预防和控制有重要意义。在过去的数十年中，研究发现，ApoE基因型别与AD的发病有关，ApoE基因型别是AD发病风险的主要遗传决定因素。一般认为ApoEE2为保护性因素而ApoEE4为危险性因素。冠心病(CoronaryAtheroscleroticHeartDisease，CHD)是全球范围内最常见的死亡原因，LDL-C水平升高是CHD的最重要的病因。有效降低LDL-C水平可以阻止动脉粥样硬化进展，从而降低CHD的发病率及死亡率。他汀类药物是目前最有效的降低血浆LDL-C水平从而降低心血管疾病风险的药物。研究表明，他汀类药物的药动学存在显著的个体差异，且这种差异可能对他汀类药物的疗效及不良反应的发生产生影响。这种差异与ApoE基因型别也有密切关系。ApoE2的作用是降低胆固醇浓度，对冠状动脉硬化的发展有一定的防护作用，而ApoE4则会使血浆LDL-C、TC浓度升高，易诱发CHD。ApoE基因型别还与动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)的早期发生及发展密切相关。大量人群调查发现ApoEE4可以显著地升高健康人的总胆固醇浓度，使之易患动脉粥样硬化，相反，ApoEE2能降低胆固醇浓度。对ApoE基因型别的检测可以帮助患者疾病的诊断和指导个体化用药，提高患者的预后水平。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种检测APOE基因型别的引物，采用PCR技术，可用于快速检测动脉粥样硬化、冠心病等心脑血管疾病和老年性痴呆病患者体内APOE基因型别。所述检测APOE基因型别的引物，包括：ApoE-Exon4-F：AACAACTGACCCCGGTGGCGApoE-Exon4-R：ACCTGCTCCTTCACCTCGTC还包括测序引物，其碱基序列为：测序引物1：AACAACTGACCCCGGTGGCG测序引物2：ACCTGCTCCTTCACCTCGTC本专利技术提供了检测APOE基因型别的方法，包括以下步骤：1.抽提外周血中的基因组DNA；2.用PCR扩增步骤1中提取的DNA；3.对步骤2中的扩增产物进行测序；4.对测序结果进行判断，确定APOE基因型别：本专利技术还提供了一种检测APOE基因型别的试剂盒，包括全血基因组DNA抽提试剂、检测体系PCR反应液和测序体系试剂；扩增引物序列为：ApoE-Exon4-F：AACAACTGACCCCGGTGGCGApoE-Exon4-R：ACCTGCTCCTTCACCTCGTC。其中用于PCR的反应体系为：总体积20ul，2*PCRBuffer10ul，dNTP(2mM)4ul，APOE-Exon4-F(10uM)0.5uL，APOE-Exon4-R(10uM)0.5uL，KODFX(1U/ul)0.4ul，TemplateDNA1ul，ddH2O3.6uL。所述试剂盒用于PCR的反应体系中TemplateDNA最低浓度为10ng/μl。所述试剂盒用于PCR的反应条件为：有益效果：由于ApoE多态性具有生物学重要性，对ApoE多态性的研究是目前医学的热门话题。ApoE基因型别的检测方法很多，多年来先后采用等电聚焦电泳和基因分析术进行检测。而本方法简便，成本低，效果好。只需要一对引物就能判定ApoE基因型别。而且相较其他方法而言对结果的判定比较简单。易于推广。附图说明图1为检验一例正常人群外周血APOE基因引物效果的凝胶电泳图，共20个重复，M为MarkerDL2000，如图1所示，引物扩增有效，且条带单一。图2为退火温度的优化的电泳图：APOE基因梯度PCR凝胶电泳结果。M为MarkerDL1000，如图2所示，最适宜的退火温度为69℃。图3为三个平行样本的模板浓度的优化的电泳图，M为MarkerDL2000，由上图的电泳结果可知，引物在模板浓度为1ng/μl处出现条带非常暗或无条带，因而最低模板浓度为10ng/μl。(图中的1代表样本1、2代表样本2、3代表样本3)图4临床样本的ApoE基因第112位氨基酸位点一代测序结果，如图4所示，388位碱基位点为T。图5临床样本的ApoE基因第158位氨基酸位点一代测序结果，如图5所示，526位碱基位点为C。综合图4和图5结果可知APOE基因型别为E3。具体实施方式下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本专利技术。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。实施例1检测APOE基因型别的引物及是结合一种检测APOE基因型别的引物，该引物的设计是针对APOE第4外显子设计的扩增引物：ApoE-Exon4-F：AACAACTGACCCCGGTGGCGApoE-Exon4-R：ACCTGCTCCTTCACCTCGTC测序引物为：测序引物1：AACAACTGACCCCGGTGGCG测序引物2：ACCTGCTCCTTCACCTCGTC一种检测APOE基因-型别的试剂盒，包括(i)全血基因组DNA抽提试剂；(ii)检测体系PCR反应液；(iii)测序体系试剂；其中，外周血基因组DNA提取可采用天根生物科技有限公司的试剂盒，血液/细胞/组织基因组DNA抽提可参照试剂盒(天根生物)的操作流程。实施例2检测APOE基因型别的方法检测APOE基因型别的方法，包括以下步骤：(1)全血基因组DNA提取1)于1.5ml离心管底部加入20μlQIAGENProtease(或proteinaseK)。.2)离心管中加入200μl血浆。3)加入200μlBufferAL，振荡15s。(注意：不可将QIAGENProtease或protein本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.检测APOE基因型别的引物，其特征在于：扩增ApoE基因第4号外显子的扩增引物序列为：ApoE‑Exon4‑F：AACAACTGACCCCGGTGGCGApoE‑Exon4‑R：ACCTGCTCCTTCACCTCGTC。

【技术特征摘要】
1.检测APOE基因型别的引物，其特征在于：扩增ApoE基因第4号外显子的扩增引物序列为：ApoE-Exon4-F：AACAACTGACCCCGGTGGCGApoE-Exon4-R：ACCTGCTCCTTCACCTCGTC。2.如权利要求1所述的引物，其特征在于，还包括测序引物，测序引物序列为：测序引物1：AACAACTGACCCCGGTGGCG测序引物2：ACCTGCTCCTTCACCTCGTC。3.检测ApoE基因型别的方法，包括以下步骤：(1)抽提外周血中的基因组DNA；(2)用PCR扩增步骤1中提取的DNA；(3)对步骤2中的扩增产物进行测序；(4)对测序结果进行...

【专利技术属性】
技术研发人员：董绍斌，吴鹏飞，王淑一，
申请(专利权)人：南昌艾迪康医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：江西,36