获得谷子用于遗传转化的胚性愈伤组织和遗传转化的方法技术

本发明专利技术公开了一种获得谷子用于遗传转化的胚性愈伤组织和遗传转化的方法。本发明专利技术提供了获得谷子用于遗传转化的胚性愈伤组织的方法，包括：a1)将谷子的外植体接种于诱导培养基上进行诱导培养，获得初生愈伤组织；a2)将所述初生愈伤组织进行悬浮培养和继代，得到胚性愈伤组织细胞悬浮系；所述胚性愈伤组织细胞悬浮系即为用于遗传转化的胚性愈伤组织。本发明专利技术首次提供了一种谷子成熟种子来源的胚性愈伤组织，通过该胚性细胞的悬浮培养扩增；可以实现快速、高效、稳定的谷子遗传转化。本发明专利技术为开展谷子高光效(C4)和耐旱抗逆等功能基因研究奠定了技术基础，为加快谷子的遗传育种研究和现代化农业发展提供了技术支持。

【技术实现步骤摘要】
获得谷子用于遗传转化的胚性愈伤组织和遗传转化的方法
本专利技术涉及植物组培以及植物基因工程领域，具体涉及一种获得谷子用于遗传转化的胚性愈伤组织和农杆菌介导的遗传转化的方法。
技术介绍
谷子(Setariaitalica(L.)P.Beauv.)，起源于我国，其驯化栽培历史可以追溯到11500年前，是世界范围内最古老的作物之一。谷子属禾本科(Gramineae)、黍亚科(Panicoideae)、黍族(Paniceae)、狗尾草亚族(Setatuubae)、狗尾草属(Setaria)，和玉米(Zeamays.)、高粱(Sorghumbicolor)、珍珠粟(Pennisetumglaucum)、黍稷(Panicummiliaceum)、甘蔗(Saccharumofficinarum)等重要农作物有着很近缘的关系。谷子具有耐旱节水、耐瘠薄、营养高效和高光效(C4植物)等特点，这些特征正是作物遗传改良的发展方向。因此谷子在功能基因组研究中受到越来越增强的重视。尽管近年来对于抗旱耐逆和C4光合作用的分子生物学基础的研究已经有了多个模式物种，如拟南芥(Arabidopsisthaliana)、玉米和高粱等。但拟南芥属双子叶植物，和主要禾本科作物玉米、水稻、小麦等遗传上差距巨大，其抗旱耐逆研究结果难以在这些作物上应用。虽然玉米和高粱一直作为C4光合作用研究的模式作物，但玉米是古四倍体，基因组复杂；且玉米和高粱都具有植株高大，难以在实验室培养间操作，生长周期长等问题，严重影响了研究效率，限制了它们成为模式作物进行相关研究。因此，为了弥补拟南芥等在抗旱耐逆方面研究不足，以及现有C4模式植物的缺陷，急需寻找一个基因组较小、易于转化、自花授粉、抗旱耐逆的C4高光效的作物作为新的C4模式物种进行研究。谷子因是二倍体(2n＝2x＝18)，基因组仅有470M，大小与水稻相当(目前豫谷1号等多个基因型的基因组测序已经完成)，且为自花授粉作物(天然异交率3％～5％)，植株矮小适合实验室操作，生育期短且单株自交结实数量巨大，非常适合作为新的C4光合作用和禾本科抗旱耐逆研究的模式作物开展相关研究。基因的功能研究以高效的遗传转化为前提，但已有的植物遗传转化体系在谷子均无效或者效率很低，遗传转化困难是限制谷子成为模式植物的首要制约因素。目前，有关谷子遗传转化成功的报道仅有几例，且转化效率偏低。而转化效率受诸多因素影响，如受体类型和状态、培养基构成、外界环境因素等，虽然已有20余年的研究历史，至今成熟的规模化谷子转基因技术体系仍未建立。谷子遗传转化最早是利用基因枪法，董云洲与刁现民分别采取了轰击谷子花粉和胚性愈伤组织均获得了转基因植株，但是转化效率很低。农杆菌介导的谷子转化方面，王永芳与刘颖慧等都能利用农杆菌成功获得转基因谷子，但是转化效率也很低，且稳定性差，不同批次的遗传转化效率差异巨大。尽管多个研究组已经获得了谷子的转基因植株，但是大多采用幼穗为外植体，幼穗的供应受季节、培养条件和数量等众多因素限制，不能随时批量开展遗传转化，且转化效率普遍偏低，达不到稳定高效遗传转化的目的。最近印度与英国的研究小组合作报道了利用种子诱导胚芽为外植体，农杆菌侵染之后直接再生成苗的方法。他们比较了三种激素KT、BAP和TDZ对于诱导胚芽的影响，认为在MS上添加0.5mg/L的BAP效果最好。这是目前国际上首次关于利用谷子胚芽为外植体直接再生，由农杆菌介导遗传转化成功的相关报道。但是其在谷子转化的稳定性与实用性还需要实践检验，且利用胚芽为外植体对于种子的要求极高，由于每粒种子是一个独立的外植体，种子的质量均一性难以保障，且每粒种子诱导胚芽的状态与种子自身的状态有关，所以批次间难以保障一致性；另外利用农杆菌直接转化再生植株虽然节省了转化的时间，但是由于产生的T0代植株并非起源于单一的细胞，所以存在大量的嵌合体，不利于后代植株得到纯合转基因株系。综上所述，建立稳定、高效的谷子遗传转化系统迫在眉睫，这种技术的建立决定了谷子能否成为研究C4光合作用和禾本科作物抗旱耐逆的模式植物。
技术实现思路
本专利技术的目的是利用成熟胚(种子)获得谷子胚性愈伤，利用这种胚性愈伤可以进行高效且稳定的农杆菌介导的遗传转化，从而解决谷子难以进行遗传转化的关键瓶颈问题，建立规模化的谷子遗传转化体系，使谷子真正发展成为功能基因研究是模式植物。为了实现上述目的，本专利技术提供了一种诱导和扩繁谷子胚性愈伤组织的方法，包括将谷子成熟种子接种于愈伤诱导培养基以获得初生愈伤组织，再通过悬浮细胞系的方法来诱导和扩增胚性愈伤组织。第一方面，本专利技术要求保护一种获得谷子用于遗传转化的胚性愈伤组织的方法。本专利技术所提供的获得谷子用于遗传转化的胚性愈伤组织的方法，具体可包括如下步骤：(a1)将谷子的外植体接种于诱导培养基上进行诱导培养，获得初生愈伤组织；初生愈伤组织为外植体接种于诱导培养基后，细胞核内发生了变化，反应了愈伤组织诱导期间核变异的结果。是本领域的公知技术术语。(a2)将所述初生愈伤组织进行悬浮培养和继代，得到胚性愈伤组织细胞悬浮系；所述胚性愈伤组织细胞悬浮系即为用于遗传转化的胚性愈伤组织。进一步地，步骤(a1)中，所述诱导培养基的溶剂为水，溶质为MS盐、N6维生素、脯氨酸、天冬氨酸、水解酪蛋白、蔗糖、2,4-D、KT、Dicamba(麦草畏)和植物凝胶；在所述诱导培养基中，所述MS盐的终浓度可为2.2-4.5g/L(如4.3333g/L)、所述N6维生素的终浓度可0.5-5ml/L、脯氨酸的终浓度可为0.1-5g/L、天冬氨酸的终浓度可为0.1-5g/L、水解酪蛋白的终浓度可为0.1-5g/L、蔗糖的终浓度可为5-100g/L、2,4-D的终浓度可为0.1-5mg/L、KT的终浓度可为0.1-2mg/L、Dicamba(麦草畏)的终浓度可为0.1-2mg/L、植物凝胶的终浓度可为2.6g/L。在本专利技术的具体实施方式中，在所述诱导培养基中，所述MS盐的终浓度具体为4.3333g/L、所述N6维生素的终浓度具体为1ml/L、脯氨酸的终浓度具体为0.2g/L、天冬氨酸的终浓度具体为0.2g/L、水解酪蛋白的终浓度具体为0.3g/L、蔗糖的终浓度具体为30g/L、2,4-D的终浓度具体为1mg/L、KT的终浓度具体为0.2mg/L、Dicamba的终浓度具体为0.5mg/L、植物凝胶的终浓度具体为2.6g/L；pH5.6。进一步地，步骤(a2)中，将所述初生愈伤组织进行悬浮培养和继代时采用的悬浮培养基的溶剂为水，溶质为MS盐、N6维生素、脯氨酸、水解酪蛋白、蔗糖、2,4-D和KT；在所述悬浮培养基中，所述MS盐的终浓度为4.33g/L，所述N6维生素的终浓度为1ml/L、脯氨酸的终浓度可为0.1-5g/L、水解酪蛋白的终浓度可为0.1-5g/L、蔗糖的终浓度可为5-100g/L、2,4-D的终浓度可为0.1-5mg/L、KT的终浓度可为0.1-2mg/L。在本专利技术的具体实施方式中，在所述悬浮培养基中，所述MS盐的终浓度为4.33g/L、所述N6维生素的终浓度为1ml/L、脯氨酸的终浓度具体为1g/L、水解酪蛋白的终浓度具体为0.3g/L、蔗糖的终浓度具体为30g/L、2,4-D的终浓度具体为1mg/L、KT的终本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种获得谷子用于遗传转化的胚性愈伤组织的方法，包括如下步骤：(a1)将谷子的外植体接种于诱导培养基上进行诱导培养，获得初生愈伤组织(a2)将所述初生愈伤组织进行悬浮培养和继代，得到胚性愈伤组织细胞悬浮系；所述胚性愈伤组织细胞悬浮系即为用于遗传转化的胚性愈伤组织。

【技术特征摘要】
1.一种获得谷子用于遗传转化的胚性愈伤组织的方法，包括如下步骤：(a1)将谷子的外植体接种于诱导培养基上进行诱导培养，获得初生愈伤组织(a2)将所述初生愈伤组织进行悬浮培养和继代，得到胚性愈伤组织细胞悬浮系；所述胚性愈伤组织细胞悬浮系即为用于遗传转化的胚性愈伤组织。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(a1)中，所述诱导培养基的溶剂为水，溶质为MS盐、N6维生素、脯氨酸、天冬氨酸、水解酪蛋白、蔗糖、2,4-D、KT、Dicamba和植物凝胶；在所述诱导培养基中，所述MS盐的终浓度为2.2-4.5g/L、所述N6维生素的终浓度为0.5-5ml/L、脯氨酸的终浓度为0.1-5g/L、天冬氨酸的终浓度为0.1-5g/L、水解酪蛋白的终浓度为0.1-5g/L、蔗糖的终浓度为5-100g/L、2,4-D的终浓度为0.1-5mg/L、KT的终浓度为0.1-2mg/L、Dicamba的终浓度为0.1-2mg/L、植物凝胶的终浓度为2.6g/L；和/或步骤(a2)中，将所述初生愈伤组织进行悬浮培养和继代时采用的悬浮培养基的溶剂为水，溶质为MS盐、N6维生素、脯氨酸、水解酪蛋白、蔗糖、2,4-D和KT；在所述悬浮培养基中，所述MS盐的终浓度为4.33g/L、所述N6维生素的终浓度为1ml/L、脯氨酸的终浓度为0.1-5g/L、水解酪蛋白的终浓度为0.1-5g/L、蔗糖的终浓度为5-100g/L、2,4-D的终浓度为0.1-5mg/L、KT的终浓度为0.1-2mg/L。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤(a1)中，进行所述诱导培养的条件为28℃暗培养20-40天；和/或步骤(a2)中，进行所述悬浮培养和继代是按照包括如下步骤的方法进行的：将所述初生愈伤组织接种于所述悬浮培养基中，于28-30℃进行振荡悬浮培养，10-20天后进行第一次继代，之后间隔7-10天继代一次，继代时的培养基和培养条件不变。4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述外植体为成熟胚。5.一种将谷子初生愈伤组织诱导为能够用于遗传转化的胚性愈伤组织的方法，包括如下步骤：将谷子初生愈伤组织按照权利要求1-4任一中步骤(a2)所述的方法进行悬浮培养和继代，得到胚性愈伤组织细胞悬浮系；所述胚性愈伤组织细胞悬浮系即为用于遗传转化的胚性愈伤组织。6.一种谷子的遗传转化方法，包括如下步骤：(b1)将利用权利要求1-5中任一所述方法获得的用于遗传转化的胚性愈伤组织接种于预培养培养基上进行预培养，得到预培养后愈伤组织；(b2)将所述预培养后愈伤组织于30-60℃条件下进行不超过10min的热击处理，得到预处理后愈伤组织；(b3)用含有目的基因表达载体的农杆菌侵染液侵染所述预处理后愈伤组织，将侵染后的愈伤组织接种于共培养培养基上进行共培养，得到共培养后愈伤组织；(b4)将所述共培养后愈伤组织接种到筛选培养基上进行培养，得到抗性愈伤组织；(b5)将所述抗性愈伤组织接种到分化再生培养基上进行培养，得到再生苗。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤(b1)中，所述预培养培养基的溶剂为水，溶质为MS盐、N6维生素、脯氨酸、天冬氨酸、水解酪蛋白、蔗糖、2,4-D和植物凝胶；在所述预培养培养基中，所述MS盐的终浓度为2-4.33g/L、所述N6维生素的终浓度为0.5-5ml/L、脯氨酸的终浓度为0.1-5g/L、天冬氨酸的终浓度为0.1-5g/L、水解酪蛋白的终浓度为0.1-5g/L、蔗糖的终浓度为5-100g/L、2,4-D的终浓度为0.1-5mg/L、植物凝胶的终浓度为2.6g/L；和/或步骤(b2)中，所述热击处理是在共培养液中进行的；所述共培养液的溶剂为水，溶质为N6盐、N6维生素、2,4-D、水解酪蛋白、蔗糖、肌醇、葡萄糖和乙酰丁香酮；在所述共培养液中，所述N6盐的终浓度为4g/L、所述N6维生素的终浓度为1ml/L、2,4...

【专利技术属性】
技术研发人员：隋毅，张皓珊，吴传银，刁现民，
申请(专利权)人：中国农业科学院作物科学研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11