一种谷物胚来源活性成分—纳米级外泌体的制备方法技术

本发明专利技术提供一种谷物胚来源活性成分—纳米级外泌体的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：(1)谷物胚的获取；(2)谷物胚的脱脂；(3)谷物胚液的制取；(4)陶瓷膜除杂；（5）微滤除菌；上清液的提取；(6)纳滤浓缩；纳米级均质处理；（7）活性成分的络合及纳米级膜泡形成。纳米级外泌体的浓度和粒径分布如图5.本发明专利技术还提供一种谷物胚来源活性成分—纳米级外泌体的制备方法，所述谷物胚来源活性成分外泌体应用于肿瘤的治疗。本发明专利技术采用谷物胚制备外泌体，具有原料来源丰富，成本低，可大量生产等优点，使规模化利用外泌体成为现实。

Preparation of a nano scale exosbody from a cereal embryo derived active ingredient

The present invention provides a preparation method of nano-scale exosome, an active ingredient derived from grain embryo, which comprises the following steps: (1) acquisition of grain embryo; (2) degreasing of grain embryo; (3) preparation of grain embryo liquid; (4) removal of impurities by ceramic membrane; (5) microfiltration; extraction of supernatant; (6) nanofiltration concentration; nano-scale homogenization. Treatment (7) the complexation of active components and the formation of nanoscale membrane vesicles. The present invention also provides a preparation method of nano-scale exosome, an active ingredient derived from grain embryo, which is used in the treatment of tumor. The invention adopts grain embryo to prepare exosome, which has the advantages of abundant source of raw materials, low cost, and large-scale production, so that large-scale utilization of exosome becomes a reality.

【技术实现步骤摘要】
一种谷物胚来源活性成分—纳米级外泌体的制备方法
本专利技术属于药物研发领域，具体涉及纳米级外泌体的制备及应用。
技术介绍
小麦味甘性平，具有养心，益肾，和血，健脾四大主要功效；小麦是世界上的主要粮食作物之一，我国的小麦总产量占世界第一位，年总产量为1.10万吨。小麦胚是小麦籽粒的组成部分，占小麦籽粒重量的2.5%～3.0%，麦胚中酶类中的谷胱甘肽过氧化酶，是一种效果极好的天然抗氧化剂，其抗氧化能力比维生素E强500倍，是一种延返衰老防癌的有效功能因子。小麦胚芽中所含胚芽凝聚素具有抗微生物和抗诱变性等多种生物效应，与脂肪细胞反应，有类似胰岛素的作用，能激活葡萄糖氧化酶降低血糖含量，能诱导巨噬细胞溶解肿瘤细胞。小麦胚芽可保持血红细胞的完整性，调节体内化合物的合成，促进血红细胞的生物合成。促进细胞呼吸，保护肺组织免受空气污染。改善血液循环，防止胆固醇及中性脂肪囤积在血液内，以防范心脏病，脑中风的产生。外泌体（exosomes）是一种可由多种细胞分泌的直径约为30-100nm的双层膜结构的杯状小囊泡。Exosomes能在细胞间传递蛋白、mRNA、microRNA等活性物质,参与许多重要的生理、病理过程,其独特作用受到越来越多关注。目前exosomes主要从细胞培养上清、肿瘤组织的渗出液等材料中获取，分离方法主要有滤膜过滤法，超速离心法，蔗糖密度梯度离心法。从细胞培养上清等来源中获取exosome，材料来源有限，材料成本较高，所获得的exosomes含量很低，提纯后的exosomes成本更高，这就制约了exosomes的大规模工业化生产。因此，探索从来源丰富的植物原料中提取exosomes，使其能够实现生产成本降低及产量提高，对于exosomes的大规模应用具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种原料来源丰富、成本低、可大量生产的纳米级外泌体的制备方法，可应用于肿瘤的治疗。一种谷物胚来源活性成分—纳米级外泌体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：步骤1，谷物胚的获取：选择优质小麦（玉米、大米）等机械脱胚得到的完整的谷物胚；粉碎到120目；步骤2，谷物胚的脱脂：亚临界萃取脱出胚芽油，得到胚芽粕；步骤3，谷物胚液的制取：以重量份计，步骤2中获取的谷物胚加入10-20份蒸馏水，均质得到谷物胚液；步骤4，陶瓷膜除杂：将所述谷物胚液采用0.22um陶瓷膜过滤除去残渣，收集滤过的一次上清液；步骤5，微滤除菌：将所述步骤4的一次上清液，采用0.22um陶瓷膜过滤除去除菌，收集滤过的二次上清液（保留100nm以下的活性成分）；步骤6，纳滤浓缩：将所述步骤5的二次上清液，采用30nm反渗透膜除去水和其它分子，浓缩5-20倍，收集滤过的浓缩液（保留30nm以上的活性成分）；步骤7，活性成分的络合及膜泡形成：在步骤6的浓缩液中加入2%（相对于总体积）聚乙二醇（PEG-400）或聚乙二醇（PEG-800）的均质络合反应3-5小时，即形成稳定谷物胚来源纳米级活性成分外泌体。其中，所述植物原料为小麦胚、玉米胚或大米胚；其中，所述分散性、生理惰性（稳定剂）、纳米级被膜剂、缓释载体均为聚乙二醇（PEG-400）或聚乙二醇（PEG-800）。优选的，如权利要求1谷物胚来源活性成分—纳米级外泌体的制备方法，其特征在于，所述植物原料为小麦胚、玉米胚或大米胚；优选的，如权利要求1谷物胚来源活性成分—纳米级外泌体的制备方法，其特征在于，所述分散性、生理惰性（稳定剂）、纳米级被膜剂、缓释载体均为聚乙二醇（PEG-400）或聚乙二醇（PEG-800）。附图说明图1实施例1外泌体的浓度和粒径分布。图2实施例2外泌体的浓度和粒径分布。图3实施例3外泌体的浓度和粒径分布。图4实施例4外泌体的浓度和粒径分布。图5实施例1-4外泌体的浓度和粒径分布。具体实施方式实施例1步骤1，谷物胚的获取：选择优质小麦等机械脱胚得到的完整的麦胚；取麦胚10g粉碎到120目；步骤2，谷物胚的脱脂：亚临界萃取脱出胚芽油，得到胚芽粕9g；步骤3，谷物胚液的制取：以重量份计，选骤2中获取的胚芽粕加入12份蒸馏水(108g)，均质得到麦胚悬浊液；步骤4，陶瓷膜除杂：将所述麦胚悬浊液采用0.22um陶瓷膜过滤除去残渣，收集滤过的一次上清液105g；步骤5，微滤除菌：将所述步骤4的一次上清液，采用0.1um陶瓷膜过滤除去除菌，收集滤过的二次上清液103g（保留100nm以下的活性成分）；步骤6，纳滤浓缩：将所述步骤5的二次上清液，采用30nm反渗透膜除去水和其它分子，浓缩10倍以上，收集滤过的浓缩液10g（保留30nm以上的活性成分）；步骤7，活性成分的络合及膜泡形成：在步骤6的浓缩液中加入1%（相对于总体积）聚乙二醇（PEG-400）0.1g的均质络合反应3小时，即形成稳定麦胚来源纳米级活性成分外泌体。通过纳米颗粒跟踪分析技术（NTA）确定Exosome的粒径数量分布如实施例图1。实施例2一种谷物胚来源活性成分—纳米级外泌体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：步骤1，谷物胚的获取：选择优质小麦等机械脱胚得到的完整的麦胚；取麦胚10g粉碎到120目；步骤2，谷物胚的脱脂：亚临界萃取脱出胚芽油，得到胚芽粕9g；步骤3，谷物胚液的制取：以重量份计，选骤2中获取的胚芽粕加入16份蒸馏水(144g)，均质得到麦胚悬浊液；步骤4，陶瓷膜除杂：将所述麦胚悬浊液采用0.22um陶瓷膜过滤除去残渣，收集滤过的一次上清液139g；步骤5，微滤除菌：将所述步骤4的一次上清液，采用0.1um陶瓷膜过滤除去除菌，收集滤过的二次上清液135g（保留100nm以下的活性成分）；步骤6，纳滤浓缩：将所述步骤5的二次上清液，采用30nm反渗透膜除去水和其它分子，浓缩13倍以上，收集滤过的浓缩液10g（保留30nm以上的活性成分）；步骤7，活性成分的络合及膜泡形成：在步骤6的浓缩液中加入1.5%（相对于总体积）聚乙二醇（PEG-400）0.15g的均质络合反应3.5小时，即形成稳定麦胚来源纳米级活性成分外泌体。通过纳米颗粒跟踪分析技术（NTA）确定Exosome的粒径数量分布如实施例图2。实施例3一种谷物胚来源活性成分—纳米级外泌体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：步骤1，谷物胚的获取：选择优质小麦等机械脱胚得到的完整的麦胚；取麦胚10g粉碎到120目；步骤2，谷物胚的脱脂：亚临界萃取脱出胚芽油，得到胚芽粕9g；步骤3，谷物胚液的制取：以重量份计，选骤2中获取的胚芽粕加入18份蒸馏水(162g)，均质得到麦胚悬浊液；步骤4，陶瓷膜除杂：将所述麦胚悬浊液采用0.22um陶瓷膜过滤除去残渣，收集滤过的一次上清液156g；步骤5，微滤除菌：将所述步骤4的一次上清液，采用0.1um陶瓷膜过滤除去除菌，收集滤过的二次上清液151g（保留100nm以下的活性成分）；步骤6，纳滤浓缩：将所述步骤5的二次上清液，采用30nm反渗透膜除去水和其它分子，浓缩15倍以上，收集滤过的浓缩液10g（保留30nm以上的活性成分）；步骤7，活性成分的络合及膜泡形成：在步骤6的浓缩液中加入1%（相对于总体积）聚乙二醇（PEG-800）0.1g的均质络合反应4小时，即形成稳定麦胚来源纳米级活性成分外泌体本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种谷物胚来源活性成分—纳米级外泌体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：步骤1，谷物胚的获取：选择优质小麦（玉米、大米）等机械脱胚得到的完整的谷物胚；粉碎到120目；步骤2，谷物胚的脱脂：亚临界萃取脱出胚芽油，得到胚芽粕；步骤3，谷物胚液的制取：以重量份计步骤2中获取的谷物胚加入10～20份蒸馏水，均质得到谷物胚液；步骤4，陶瓷膜除杂：将所述谷物胚液采用0.22 um ‑0.45 um陶瓷膜过滤除去残渣，收集滤过的一次上清液；步骤5，微滤除菌：将所述步骤4的一次上清液，采用0.1 um ‑0.22 um陶瓷膜过滤除去除菌，收集滤过的二次上清液（保留100 nm以下的活性成分）；步骤6，纳滤浓缩：将所述步骤5的二次上清液，采用30nm反渗透膜除去水和其它分子，浓缩5‑15倍，收集滤过的浓缩液（保留30 nm以上的活性成分）；步骤7，活性成分的络合及膜泡形成：在步骤6的浓缩液中加入1‑5%（相对于总体积）聚乙二醇（PEG‑400）或聚乙二醇（PEG‑800）的均质络合反应1‑5小时，即形成稳定谷物胚来源纳米级活性成分外泌体。

【技术特征摘要】
1.一种谷物胚来源活性成分—纳米级外泌体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：步骤1，谷物胚的获取：选择优质小麦（玉米、大米）等机械脱胚得到的完整的谷物胚；粉碎到120目；步骤2，谷物胚的脱脂：亚临界萃取脱出胚芽油，得到胚芽粕；步骤3，谷物胚液的制取：以重量份计步骤2中获取的谷物胚加入10～20份蒸馏水，均质得到谷物胚液；步骤4，陶瓷膜除杂：将所述谷物胚液采用0.22um-0.45um陶瓷膜过滤除去残渣，收集滤过的一次上清液；步骤5，微滤除菌：将所述步骤4的一次上清液，采用0.1um-0.22um陶瓷膜过滤除去除菌，收集滤过的二次上清液（保留100nm以下的活性成分）；步骤6，纳滤浓缩：将所述步骤...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄继红，吕行，纪小国，惠明，张相生，赵祎，廖爱美，张亚奇，
申请(专利权)人：河南工业大学，
类型：发明
国别省市：河南,41