一种水母雪莲高产黄酮细胞系及其制备方法技术

本发明专利技术提供了一种水母雪莲高产黄酮细胞系的制备方法及培养基，其制备方法为：采用水母雪莲种子诱导愈伤组织；将获得的愈伤组织进行固体继代培养；用目测法继代培养的愈伤组织中直接挑选总黄酮的含量高的细胞系；转到液体培养，再从液体转入到固体培养，如此不断地反复筛选、继代多次后得到成长迅速、总黄酮的含量较高产细胞系。用本发明专利技术制备的细胞系和培养基，细胞在光照悬浮培养温度25℃左右，其细胞生长速率可达45g‑50g干重/升/月，黄酮类化合物的含量可达培养物干重的12％。

A high yield flavonoid cell line of Saussurea Medusa and preparation method thereof

The invention provides a preparation method and a culture medium for a high-yield flavonoid cell line of Saussurea medusa. The preparation method is as follows: the callus is induced by Saussurea Medusa seeds; the obtained callus is subcultured in solid state; and the cell line with high content of total flavonoids is selected directly from the SUBCULTURED CALLUS by visual method; To liquid culture, and then transferred from liquid to solid culture, so repeatedly screened and subcultured for many times to get rapid growth, total flavonoids content of high-yield cell lines. The cell line and the culture medium prepared by the invention have the growth rate of 45 g to 50 g dry weight/liter/month and the content of flavonoids can reach 12% of the dry weight of the culture material when the cell is cultured at about 25 C in light suspension.

【技术实现步骤摘要】
一种水母雪莲高产黄酮细胞系及其制备方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种水母雪莲高产黄酮细胞系的制备方法及培养基。
技术介绍
水母雪莲(SausureamedusaMaxim.)是藏药“雪莲”药材的原植物，分布在我国青海、甘肃、西藏等地，是藏药中的名贵药材。雪莲中含黄酮、生物碱、内酯、甾醇、挥发油、多糖等多种成分，其有效成分主要为黄酮类化合物。黄酮类化合物的药理作用包括抗癌、抗肿瘤，抗心脑血管疾病，镇咳祛痰，抗炎、镇痛作用，免疫调节作用，雌性激素样作用，抗菌及抗病毒作用，抗氧化、抗衰老作用，抗辐射。以黄酮类化合物为有效成分的雪莲注射液治疗偏头痛效果显著。又如用来治疗偏瘫的雪莲通脉丸、雪莲注射液和治疗脑动脉硬化与缺血性中风的雪莲通脉口服液，都是以黄酮类化合物含量为质量标准的。雪莲生长在海拔2400米至4000米以下的石缝、砾石坡和湿润沙地上，属于生长期较长的耐寒植物，通常需用5年时间才能生长为成熟的植株。由于雪莲药用价值高、资源贫乏。导致掠夺式盗挖严重，已经威胁到了雪莲物种的生存，且采集野生雪莲对野生资源具有严重的破坏性。雪莲中有效成分结构复杂，难以化学合成。通过植物细胞大量培养生产植物药可不受自然条件的限制，对药物质量容易控制。不占用耕地面积，以及对保护国家珍稀植物物种，维护生物多样性及持续发展具有重要意义。但是，目前采用植物细胞进行培养，其获得有效成分黄酮类化合物含量低，通常只有干重的6-7％左右，对于能产生较高黄酮类化合物产量细胞系，一直较难培育，如何能获得一种较高黄酮类化合物含量、发酵期短的细胞系的方法，更是比较困难。
技术实现思路
为解决现有技术的上述技术问题，本专利技术提供一种水母雪莲高产黄酮细胞系的制备方法，该方法所获得的黄酮高产细胞系，其遗传性能稳定，黄酮含量高，细胞悬浮培养易形成细胞聚集体，比较适合于大型生物反应器规模化的批量生产。为实现上述目的，本专利技术采用以下的技术方案为：一种水母雪莲高产黄酮细胞系的制备方法，其包括如下步骤：S1、采用水母雪莲种子诱导愈伤组织；S2、将步骤S1获得的愈伤组织进行固体继代培养；S3、用目测法从步骤S2中的愈伤组织中直接挑选总黄酮的含量高的细胞系；S4、将步骤S3获得的细胞系从固体培养转到液体培养，再从液体转入到固体培养，如此不断地反复筛选、继代多次得到成长迅速、总黄酮的含量较高的细胞系。如上所述的制备方法，优选地，所述方法还包括：S5、将步骤S4获得的所述较高产细胞系作60Coγ-射线照射诱变，之后采用小细胞团筛选法，获得总黄酮高产量的细胞系。如上所述的制备方法，优选地，所述步骤S1包括将水母雪莲种子消毒后，去掉外壳和种皮，然后接在含3mg/L的2,4-二氯苯氧基乙酸的培养基中，25℃暗培养，30d后从种子胚轴和子叶边缘能够生长出颗粒状愈伤组织，每2周继代一次。如上所述的制备方法，优选地，所述消毒为先用70-75％乙醇消毒1分钟，无菌水冲洗，再用2％的次氯酸钠溶液振荡消毒60-62min，再用无菌水冲洗。如上所述的制备方法，优选地，所述步骤S2中愈伤组织的培养采用的培养基中添加有0.2mg/L的苄氨基腺嘌呤，2mg/L萘乙酸进行继代培养。如上所述的制备方法，优选地，在所述步骤S2中，采用58.4μmol·m-2·s-1日光灯照射，25℃下培养，每隔2周继代1次。如上所述的制备方法，优选地，所述步骤S4中，所述继代为12-30次。如上所述的制备方法，优选地，采用的培养基的配方为：大量元素：NH4NO31200mg/L，KNO31200mg/L，CaCl2·2H2O300mg/L，MgSO4·7H2O370mg/L，KH2PO4300mg/L；微量元素：H3BO36.2mg/L，MnSO4·4H2O22.3mg/L，ZnSO4·7H2O10mg/L，Na2MnO4·2H2O0.25mg/L，CuSO4·5H2O0.025mg/L，CoCl2·6H2O0.025mg/L，FeSO4·7H2O22mg/L，Na2-EDTA·2H2O30mg/L；有机成分：肌醇100mg/L，烟酸0.5mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，盐酸硫胺素0.5mg/L，甘氨酸2mg/L，蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH为5.8，其中，液体培养时不添加琼脂，在所述步骤S1中所用的培养基中为所述大量元素减半的培养基。如上所述水母雪莲高产黄酮细胞系在用于制备黄酮类化合物中的应用。一种用于水母雪莲高产黄酮细胞系的培养基，所述培养基的配方为：含有1200mg/L的NH4NO3，1200mg/L的KNO3，300mg/L的CaCl2·2H2O，370mg/L的MgSO4·7H2O，300mg/L的KH2PO4；6.2mg/L的H3BO3，22.3mg/L的MnSO4·4H2O，10mg/L的ZnSO4·7H2O，0.25mg/L的0.25mg/L的Na2MnO4·2H2O，0.025mg/L的CuSO4·5H2O，0.025mg/L的CoCl2·6H2O，22mg/L的FeSO4·7H2O，30mg/L的Na2-EDTA·2H2O；100mg/L的肌醇，0.5mg/L的烟酸，0.5mg/L的盐酸吡哆醇，0.5mg/L的盐酸硫胺素，2mg/L的甘氨酸，30g/L的蔗糖和7g/L的琼脂，pH为5.8。本专利技术的有益效果为：本专利技术方法提供的一种水母雪莲高产黄酮细胞系，细胞悬浮培养在25℃左右，其细胞生长速率可达45g-50g干重/升/月，黄酮类化合物的含量可达培养物干重的12％，生长周期为12d。但现有雪莲细胞的固体培养需要14-15d。本专利技术还提供一种适用于水母雪莲细胞系的培养基，有助于水母雪莲细胞系的生长及黄铜的产生。本专利技术较已有技术相比具有如下优点及积极效果:1、本专利技术采用雪莲种子进行培育产生愈伤组织，比与用雪莲外植体诱导愈伤组织相比，更加方便获得，因为雪莲产于我国特殊地域，如从我国遥远的西藏等地区的高山上采取新鲜的外植体带到实验室作为愈伤组织诱导的材料比较困难。2、通过植物细胞大量培养进行工业化生产雪莲类黄酮化合物可保护雪莲野生资源，保护生态环境。3、对制备获得的水母雪莲高产黄酮细胞系可应用细胞大量培养进行工业化生产雪莲类黄酮化合物，不受自然条件的限制，对药物质量容易控制。4、通过人工可有效对细胞生长及黄酮含量提高的调节与控制。附图说明图1高产细胞系红色系(A-1)细胞聚集体的研究结果。图2为水母雪莲红色系(A-1)悬浮培养细胞的生长动态与黄酮含量变化曲线。具体实施方式本专利技术方法采用种子进行产生愈伤组织，比用雪莲外植体诱导愈伤组织方便，因雪莲新鲜的外植体带到实验室作为愈伤组织诱导的材料比较困难。经大量实验表明先将种子进行消毒后，去掉外壳和种皮，种子萌发速率快，产生的愈伤组织只需要30d左右，如果不除去外壳和种皮产生愈伤组织需要40d。种子消毒后，去掉外壳和种皮，种子萌发速率高，每100粒可有80粒产生愈伤组织，而不去掉外壳和种皮得种子只有50粒。并对MS培养基进行了改良，采用改良后的培养基可获得较好的效果。本专利技术中采用细胞聚集体体积大小来筛选高产细胞系，获得的细胞系产量高，较稳定，对细胞悬浮乃大规模的发酵具有重大意义。下面结合具体的实施例来说明本
技术实现思路
，但不应理解为对本专利技术的限制。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种水母雪莲高产黄酮细胞系的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤：S1、采用水母雪莲种子诱导愈伤组织；S2、将步骤S1获得的愈伤组织进行固体继代培养；S3、用目测法从步骤S2中的愈伤组织中直接挑选总黄酮的含量高的细胞系；S4、将步骤S3获得的细胞系从固体培养转到液体培养，再从液体转入到固体培养，如此不断地反复筛选、继代多次后得到成长迅速、总黄酮的含量较高的细胞系。

【技术特征摘要】
1.一种水母雪莲高产黄酮细胞系的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤：S1、采用水母雪莲种子诱导愈伤组织；S2、将步骤S1获得的愈伤组织进行固体继代培养；S3、用目测法从步骤S2中的愈伤组织中直接挑选总黄酮的含量高的细胞系；S4、将步骤S3获得的细胞系从固体培养转到液体培养，再从液体转入到固体培养，如此不断地反复筛选、继代多次后得到成长迅速、总黄酮的含量较高的细胞系。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述方法还包括：S5、将步骤S4获得的所述较高产细胞系作60Coγ-射线照射诱变，之后采用小细胞团筛选法，获得总黄酮高产量的细胞系。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1包括将水母雪莲种子消毒后，去掉外壳和种皮，然后接在含3mg/L的2,4-二氯苯氧基乙酸的培养基中，25℃暗培养，30d后从种子胚轴和子叶边缘能够生长出颗粒状愈伤组织，每2周继代一次。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述消毒为先用70-75％乙醇消毒1分钟，无菌水冲洗，再用2％的次氯酸钠溶液振荡消毒60-62min，再用无菌水冲洗。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中愈伤组织的培养采用的培养基中添加有0.2mg/L的苄氨基腺嘌呤，2mg/L萘乙酸进行继代培养。6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤S2中，采用58.4μmol·m-2·s-1日光灯照射，25℃下培养，每隔2周继代1次。7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤S4中，所述继代为12-30次。8.根据权利要求1-7中任一项所述的制备方法，其特征在于，采用的培养基的配方为：大量元素：NH4NO31200mg/L，KNO31200mg/L，CaC...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘汉石，赵德修，刘雅萍，
申请(专利权)人：大连普瑞康生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：辽宁,21