本发明专利技术提供一种载有神经细胞生长因子的硫酸软骨素纳米微球的制备方法，利用硫酸软骨素微球作为载体，包裹神经细胞生长因子，经实验证实，硫酸软骨素微球可以对神经细胞生长因子进行良好的包载和包封，并且可以在较长时间内对神经细胞生长因子的释放进行良好的控制。载体在给药后无需再次取出，在体内可以降解并代谢，其分解产物及代谢产物对人体健康无害，可在制备促神经组织修复药物中的应用。
【技术实现步骤摘要】
载有神经细胞生长因子的硫酸软骨素纳米微球的制备方法
本专利技术属于医用材料
，具体涉及一种载有神经细胞生长因子的硫酸软骨素纳米微球的制备方法及其应用。
技术介绍
天然高分子的纳米微球材料具有优异的生物相容性和可调的生物降解性，可用于药物、蛋白或基因的包埋和释放，目前已广泛用于药物控释、组织工程和再生医学等领域的研究。通常，药物在体内代谢较快，而频繁注射给药则会给病人带来极大的痛苦，选择合适的纳米载药体系，可实现药物在体内的缓慢释放，达到理想的治疗效果。当前，纳米微球材料制备技术已经被广泛地用于控制蛋白质药物释放系统。研究发现，微球体能够保护蛋白质药物，使其在体内避免被蛋白酶水解，如果蛋白质药物为抗体，可避免抗体与体内的抗原结合，发生抗体中和反应。微球体能够延长蛋白质药物的释放时间，保护其活性。在组织工程和再生医学领域，纳米微球常用于包埋细胞生长因子和基因，以提高细胞的支架的生物活性，增加支架在体内的组织诱导能力，常用来制备纳米微球的天然高分子材料包括：牛血清白蛋白、明胶、壳聚糖、淀粉及纤维素等。神经生长因子(nervegrowthfactor，NGF)能促进中枢和外周神经元的生长、发育、分化、成熟，维持神经系统的正常功能，加快神经系统损伤后的修复。在胚胎发育的一定时期内，NGF为效应神经元生存所必须。NGF及其受体广泛分布于中枢神经系统，由海马和脑皮质产生的NGF可通过胆碱能神经逆行运输至前脑基底核，维持胆碱能神经元的存活和功能。神经生长因子具有非常广泛的生物功能，除了提供神经营养、保护神经、促进神经再生长，同时还具有能影响免疫细胞的活性，进而调节免疫系统功能；可以抑制某些肿瘤的有丝分裂；促其向良性分化，促进创口组织的修复反应，促进创口愈合等等。然后，生长因子最大的缺点在于：不能保证药物在伤口部位以有效量长时间缓释。硫酸软骨素(CS)是广泛存在于人和动物软骨组织中的一类黏多糖，其成分约含50～70个双糖基本单位，分子量为1～5万，主要结构是由D-葡萄醛酸与N-2酰-D氨基半乳糖硫酸酯组成。硫酸软骨素作为结缔组织的重要组成部分，具有多种生理功能与药理作用。研究结果表明：硫酸软骨素可以清楚体内血液中的脂质和脂蛋白，清除心脏周围血管的胆固醇，防治动脉粥样硬化，并增加脂质和脂肪酸在细胞内的转换率，并能增加冠状动脉分支或侧支循环。同时，加速试验性冠状动脉硬化或栓塞所引起的心脉坏死或变性的愈合、再生或修复。能增加细胞的mRNA和DNA的生物合成以及促进细胞代谢的作用。硫酸软骨素具有抗凝血作用，每毫克硫酸软骨素A相当于0.45μ肝素的抗凝活性。这种抗凝活性并不依赖于抗凝血酶Ⅲ而发挥作用，它可以通过纤维蛋白原系统而发挥抗凝血活性，它还具有润滑和支撑的功能。京尼平是一种新型、从栀子中提取出来的天然交联剂，是一种优良的天然生物交联剂，可以与蛋白质、胶原、明胶和壳聚糖等交联制作生物材料，如人造骨骼、伤口包扎材料等，其毒性远低于戊二醛和其他常用化学交联剂，也可用于治疗肝脏疾病、降压、通便等。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种载有神经细胞生长因子的硫酸软骨素纳米微球的制备方法及其应用，利用硫酸软骨素微球作为载体，可以对神经细胞生长因子进行良好的包载和包封，并且可以在较长时间内对神经细胞生长因子的释放进行良好的控制。为解决上述技术问题，本专利技术的实施例提供一种载有神经细胞生长因子的硫酸软骨素纳米微球的制备方法，包括如下步骤：(1)量取1～20ml医用石蜡油，玻璃棒引流，缓慢加入圆底烧瓶中，然后加入0.1～1ml的司盘80，超声充分搅拌1h，搅拌条件为600rpm，混匀圆底烧瓶中的液体，形成10ml的油相体系；(2)以0.1～5ml的20mg/ml硫酸软骨素溶液作为水相，取0.5～5μgNGF加入到水相中；(3)然后用1ml移液器吸取水相缓慢地加入到油相中，于500rpm下搅拌30min，充分混匀形成乳浊液；(4)在乳浊液中缓慢加入10～100μl的10％京尼平水溶液，于1500rpm下搅拌1h；(5)搅拌停止后，将圆底烧瓶中所有混合液倒入50ml无菌离心管中，于1200rpm下离心10min，静置，去除上清液；(6)向离心管中加入10～50ml石油乙醚洗涤2次，每次充分振荡该离心管，使石油乙醚与管中的混合液充分接触，然后于室温、1000rpm条件下离心10min，静置，吸掉上清液；(7)加入10～50ml异丙醇洗涤2次，每次充分振荡该离心管，使异丙醇与管中的混合液充分接触，然后于室温、1000rpm条件下离心10min，静置，吸掉上清液；(8)加入10～50ml丙酮洗涤2次，每次充分振荡该离心管，使丙酮与管中的混合液充分接触，然后于室温、1000rpm条件下离心10min，静置，吸掉上清液；(9)室温条件下自然干燥NGF-CSMSs，最后收集，于室温、干燥处保存备用。其中，步骤(1)中，所述医用石蜡油的用量为5～15ml，所述司盘80的用量为0.～0.5ml。其中，步骤(2)中，所述20mg/ml硫酸软骨素溶液的用量为0.5～3ml，所述NGF的用量为1～3μg。其中，步骤(4)中，所述10％京尼平水溶液的用量为30～80μl。其中，步骤(6)中，所述石油乙醚的用量为30ml。其中，步骤(7)中，所述异丙醇的用量为25ml。其中，步骤(8)中，所述丙酮的用量为20ml。本专利技术的上述技术方案的有益效果如下：本专利技术利用硫酸软骨素微球作为载体，包裹神经细胞生长因子，经实验证实，硫酸软骨素微球可以对神经细胞生长因子进行良好的包载和包封，并且可以在较长时间内对神经细胞生长因子的释放进行良好的控制。载体在给药后无需再次取出，在体内可以降解并代谢，其分解产物及代谢产物对人体健康无害，可在制备促神经组织修复药物中的应用。附图说明图1为本专利技术实施例一所制备样品的释放率-时间曲线图。具体实施方式为使本专利技术要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。本专利技术公开了一种载有神经细胞生长因子的硫酸软骨素纳米微球的制备方法，包括如下步骤：(1)量取1～20ml医用石蜡油，玻璃棒引流，缓慢加入圆底烧瓶中，然后加入0.1～1ml的司盘80，超声充分搅拌1h，搅拌条件为600rpm，混匀圆底烧瓶中的液体，形成10ml的油相体系；该步骤中，不限于超声搅拌，可以于电动搅拌器上充分搅拌，或者其他搅拌方式，其中超声搅拌的效果最好。(2)以0.1～5ml的20mg/ml硫酸软骨素溶液作为水相，取0.5～5μgNGF(100uL0.01mol/L的PBS)加入到水相中；(3)然后用1ml移液器吸取水相缓慢地加入到油相中，于500rpm下搅拌30min，充分混匀形成乳浊液；(4)在乳浊液中缓慢加入10～100μl的10％京尼平水溶液，于1500rpm下搅拌1h；(5)搅拌停止后，将圆底烧瓶中所有混合液倒入50ml无菌离心管中，于1200rpm下离心10min，静置，去除上清液；(6)向离心管中加入10～50ml石油乙醚洗涤2次，每次充分振荡该离心管，使石油乙醚与管中的混合液充分接触，然后于室温、1000rpm条件下离心10min，静置，吸掉上清液；(7)加入10～50ml异丙醇洗涤2次，每次充分振荡该离心管，使异丙醇本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种载有神经细胞生长因子的硫酸软骨素纳米微球的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)量取1～20ml医用石蜡油，玻璃棒引流，缓慢加入圆底烧瓶中，然后加入0.1～1ml的司盘80，超声充分搅拌1h，搅拌条件为600rpm，混匀圆底烧瓶中的液体，形成10ml的油相体系；(2)以0.1～5ml的20mg/ml硫酸软骨素溶液作为水相，取0.5～5μg NGF加入到水相中；(3)然后用1ml移液器吸取水相缓慢地加入到油相中，于500rpm下搅拌30min，充分混匀形成乳浊液；(4)在乳浊液中缓慢加入10～100μl的10％京尼平水溶液，于1500rpm下搅拌1h；(5)搅拌停止后，将圆底烧瓶中所有混合液倒入50ml无菌离心管中，于1200rpm下离心10min，静置，去除上清液；(6)向离心管中加入10～50ml石油乙醚洗涤2次，每次充分振荡该离心管，使石油乙醚与管中的混合液充分接触，然后于室温、1000rpm条件下离心10min，静置，吸掉上清液；(7)加入10～50ml异丙醇洗涤2次，每次充分振荡该离心管，使异丙醇与管中的混合液充分接触，然后于室温、1000rpm条件下离心10min，静置，吸掉上清液；(8)加入10～50ml丙酮洗涤2次，每次充分振荡该离心管，使丙酮与管中的混合液充分接触，然后于室温、1000rpm条件下离心10min，静置，吸掉上清液；(9)室温条件下自然干燥NGF‑CSMSs，最后收集，于室温、干燥处保存备用。...
【技术特征摘要】
1.一种载有神经细胞生长因子的硫酸软骨素纳米微球的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)量取1～20ml医用石蜡油，玻璃棒引流，缓慢加入圆底烧瓶中，然后加入0.1～1ml的司盘80，超声充分搅拌1h，搅拌条件为600rpm，混匀圆底烧瓶中的液体，形成10ml的油相体系；(2)以0.1～5ml的20mg/ml硫酸软骨素溶液作为水相，取0.5～5μgNGF加入到水相中；(3)然后用1ml移液器吸取水相缓慢地加入到油相中，于500rpm下搅拌30min，充分混匀形成乳浊液；(4)在乳浊液中缓慢加入10～100μl的10％京尼平水溶液，于1500rpm下搅拌1h；(5)搅拌停止后，将圆底烧瓶中所有混合液倒入50ml无菌离心管中，于1200rpm下离心10min，静置，去除上清液；(6)向离心管中加入10～50ml石油乙醚洗涤2次，每次充分振荡该离心管，使石油乙醚与管中的混合液充分接触，然后于室温、1000rpm条件下离心10min，静置，吸掉上清液；(7)加入10～50ml异丙醇洗涤2次，每次充分振荡该离心管，使异丙醇与管中的混合液充分接触，然后于室温、1000rpm条件下离心10min，静置，吸掉上清液；(8)加入10～50ml丙酮洗涤2次，每次充分振荡该离心管，...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐大伟，王成牛，孙郁雨，崔志明，
申请(专利权)人：南通市第一人民医院，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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