一种碱性蛋白酶基因及其重组枯草芽孢杆菌菌株的构建方法技术

本发明专利技术涉及一种碱性蛋白酶基因及其重组枯草芽孢杆菌菌株的构建方法，属于基因工程领域，本发明专利技术按照枯草芽孢杆菌密码子偏好性优化碱性蛋白酶BmP的基因序列得到Bmp‑opt，同时通过基因敲除技术敲除了枯草芽孢杆菌168的碱性蛋白酶、中性蛋白酶以及中温淀粉酶得到了突变菌株Bs1。将优化后的碱性蛋白酶基因Bmp‑opt在突变菌Bs1进行表达，最终得到了高效表达碱性蛋白酶BmP的重组枯草芽孢菌株。

【技术实现步骤摘要】
一种碱性蛋白酶基因及其重组枯草芽孢杆菌菌株的构建方法
本专利技术涉及一种碱性蛋白酶基因及其重组枯草芽孢杆菌菌株的构建方法，属于基因工程领域。
技术介绍
蛋白酶是催化蛋白质水解的一类酶。根据蛋白酶的来源可分为动物性蛋白酶、植物性蛋白酶以及微生物蛋白酶。相对于动物蛋白酶和植物蛋白酶，微生物来源的蛋白酶作用范围广，水解底物种类多。微生物来源的蛋白酶根据其最适反应pH环境可将蛋白酶分为酸性、中性和碱性蛋白酶。碱性蛋白酶是一类在碱性条件下水解蛋白质的酶类，碱性蛋白酶因具有较强的水解能力，广泛的应用于食品、洗涤、饲料等工业领域。目前制备碱性蛋白酶主要有两种方式，一种是通过发酵培养产碱性蛋白酶的野生菌从而获得碱性蛋白酶；另一种是将碱性蛋白酶基因进行异源表达获得碱性蛋白酶。相对于模式菌，野生菌培养过程及培养基组成复杂，因此培养野生菌生产碱性蛋白酶生产成本较高。相对于第一种方式，将碱性蛋白酶基因进行异源表达能够有效降低其生产成本。中国专利申请201210563540.1公开了一种碱性蛋白酶及其重组表达工程菌，其通过将克劳氏芽孢杆菌(Bacillusclausii)的碱性蛋白酶基因转入枯草芽孢杆菌(Ba本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种酶活高的碱性蛋白酶Bmp‑opt基因，其基因序列如SEQ ID NO.2所示。

【技术特征摘要】
1.一种酶活高的碱性蛋白酶Bmp-opt基因，其基因序列如SEQIDNO.2所示。2.一种用于表达权利要求1所述的碱性蛋白酶Bmp-opt基因的重组枯草芽孢杆菌菌株Bs1，其特征在于，所述的重组枯草芽孢杆菌菌株的碱性蛋白酶基因、中性蛋白酶基因和中温淀粉酶基因被敲除。3.根据权利要求2所述的用于表达碱性蛋白酶Bmp-opt基因的重组枯草芽孢杆菌菌株Bs1，其特征在于，目标基因的敲除方法包括下述步骤：将枯草芽孢杆菌168接入LB培养基，37℃培养24h后，提取基因组DNA，分别使用引物扩增目标基因的上游同源臂和下游同源臂，将上下游同源臂用重叠PCR方法进行融合，将融合完成的产物进行PCR扩增，扩增产物用限制性内切酶BamHI和XbaI酶切后，连入载体Pub-At，转至大肠杆菌top10，提取质粒得到碱性蛋白酶敲除载体；使用电转化法将敲除载体转入枯草芽孢杆菌168，转化子用四环素抗性平板筛选，将在抗性平板上生长的转化子进行高温诱导使得敲除载体和枯草芽孢杆菌168同源重组，用相应引物分别进行5端同源臂和3端同源臂PCR扩增，确定同源臂单交换所发生的位置；将确定好同源臂单交换所发生位置的转化子进行无抗传代培养，连续传代10次进行点板实验，将在抗性板上不长，在无抗性板上长的转化子初步确定为目标基因缺失的枯草芽孢杆菌菌株。4.根据权利要求3所述的用于表达碱性蛋白酶Bmp-opt基因的重组枯草芽孢杆菌菌株Bs1，其特征在于，重叠PCR反应体系组成为：重叠PCR反应条件为：98℃，预变性20s；9...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘丹妮，
申请(专利权)人：横琴仲泰生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44