重组脂联素抗原、抗体及脂联素纳米胶乳增强免疫比浊法试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种重组脂联素抗原，其制备包括以下步骤：a.将高表达重组人全长脂联素蛋白的细胞株在高糖DMEM培养基中培养，培养条件为0.25～0.75L/min通氧量、3～6％二氧化碳量、5‑10％牛血清量、100～200rpm转速，使细胞株达到1～3×107的细胞数；b.将培养基更换为无血清培养基，添加0.5％维他命C，使细胞株维持1～3×107的细胞数，持续表达脂联素4～10天。本发明专利技术还公开了脂联素抗体、脂联素抗体纳米乳胶颗粒和含所述抗原、抗体纳米乳胶颗粒的试剂盒。所述试剂盒采用纳米胶乳增强免疫比浊法检测脂联素的准确度高、数据真实可靠，且对2型糖尿病及糖尿病前期的预测效果好。

【技术实现步骤摘要】
重组脂联素抗原、抗体及脂联素纳米胶乳增强免疫比浊法试剂盒
本专利技术涉及生物
，尤其涉及重组脂联素抗原、抗体及脂联素纳米胶乳增强免疫比浊法试剂盒及其应用。
技术介绍
随着社会的进步，人口年龄结构的变化及生活习惯的改变，糖尿病的发病率快速增加，已成为全球范围的流行病(AmericanDiabetesAssociation,Diabetescare36Suppl1:S67-74(2013))。根据国际糖尿病联会的资料，目前全球有超过3亿8千万的糖尿病患者，并且有46％的患者直到发生严重的糖尿病并发症之后才被发现。据统计，全球每年花费在糖尿病健康医疗方面的经费超过5480亿美元(InternationalDiabetesFederation,IDFDiabetesAtlas,6thedition/2013update(2013))。根据最近的流行病学调查，我国糖尿病患病率从1994年的1.4.％上升到2010年的11.6％，目前约有1.139亿糖尿病患者，及超过4亿9千万人处于糖尿病前期(Xuetal.,JAMA310:948-959(2013))。我国糖尿病相关的直接医疗花费占全国卫生总费用的7.6％，糖尿病已成为威胁国民健康的头号杀手。预计在未来10年中，中国用于糖尿病、心血管疾病及中风等慢性疾病的医疗费用将高达5580亿美元，由这些慢性疾病所致的死亡人数将超过8000万。糖尿病还是很多疾病的元凶。随着糖尿病的发展，患者往往会出现一系列并发症，包括心血管疾病、神经病变、视网膜病变及肾病，严重时可出现心肌梗塞、中风、足坏疽及肾衰竭。糖尿病一经确诊则无法逆转，目前还没有治愈糖尿病及其并发症的药物，现有药物只能控制血糖、延缓并发症的发生及减轻症状，患者需终生服药。而处在糖尿病前期的患者，大约有30％在十年左右会进展成为糖尿病(FerranniniE.etal.LancetDiabetesEndocrinol2:667-675(2014))。糖尿病防治的关键在于早期发现及预测糖尿病及糖尿病前期人群。脂联素(Adiponectin)是一种主要由脂肪细胞分泌的蛋白类激素，大量存在于血液循环中，在调节胰岛素敏感性及葡萄糖代谢的过程中扮演重要角色。在代谢性疾病中，脂联素具有抗糖尿病、抗动脉粥样硬化及抗炎症等功能。大量流行病学调查显示，血清/血浆中脂联素水平与胰岛素抵抗、糖尿病前期及2型糖尿病密切相关，脂联素水平在上述疾病中明显降低。了解血清/血浆中脂联素水平与糖尿病、糖尿病前期的关联可以为疾病提供有价值的信息，促进对糖尿病高发人群的跟踪随访及干预治疗，从而实现对糖尿病高风险人群的早发现、早干预、早治疗，降低糖尿病发病率。然而，脂联素检测的临床推广还面临一系列困难或障碍。首先其临床推广受限于目前脂联素的检测方法。脂联素的检测方法主要包括：酶联免疫分析法(Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay,ELISA,脂联素检测试剂盒，CN105548173A)，放射免疫分析法(Radioimmunoassay,RIA,一种脂联素浓度的测定方法,CN103076452A)，化学发光法(chemiluminescenceimmunoassay,CLIA,脂联素化学发光免疫试剂盒及其制备方法和应用，CN106199011A)等，酶联免疫分析法灵敏度高，但操作繁琐，难于实现全自动化检测；放射免疫分析法会对对操作人员产生危害，对环境造成污染，而化学发光法也存在操作繁琐成本高、仪器普及率低等缺点。这些缺点限制了现有脂联素检测方法的推广及应用，使其难于广泛的应用于科研及临床。纳米胶乳微球增强免疫分析法(Latexenhancedimmunoassay)的是近年来出现的一种较为快速、准确、稳定的液相免疫比浊检测方法，例如CN103777023B以及CN202066863U。其基本原理是利用抗原抗体特异性结合，产生免疫沉淀反应引起液相浊度变化，来检测抗原的浓度。在一定范围内，抗原的浓度越高，免疫沉淀反应就越快，液相吸光度变化也越大。该技术通过采用纳米乳胶微球偶联特异性抗体，使抗原抗体形成的免疫沉淀物体积增大，从而放大检测信号，显著提高了检测的灵敏度。然而，由于血液循环中的天然脂联素存在单体、三聚体、六聚体及多聚体等多种形式，同时也存在很高的糖基化，目前常用的实验室检测方法及市面上已有的脂联素检测方法，受限于其使用的抗体，只能识别血循环中的一种或几种脂联素形式，并且很难识别糖基化后的脂联素。天然脂联素形式的复杂性，导致不同检测方法测得的循环脂联素水平差别较大，即使是同一种检测方法，由于使用的脂联素特异性抗体不同，测得的脂联素水平也存在差别。从而导致脂联素正常值参考范围难于统一，限制了脂联素检测的临床推广。此外，受血循环中天然脂联素的浓度(约6mg/L)所限，天然脂联素仅能用于实验室中少量抗体的生产，无法进行大规模的生产，因此工业应用中利用重组的脂联素蛋白来大量生产抗体。免疫动物生产脂联素特异性多抗/单抗的重组蛋白主要是通过以下几种蛋白表达系统，包括：原核细胞表达系统、酵母表达系统、昆虫细胞表达系统及哺乳动物细胞表达系统，表达系统越高级，能完成的翻译后修饰就越全面、越复杂，其表达出的重组蛋白就越接近于人体血循环中的天然蛋白。目前脂联素重组蛋白是主要通过原核表达系统生产，由于原核表达系统过于简单，不能完成复杂的翻译后修饰，所表达的蛋白在三级结构上与天然蛋白可能存在差异，而且该系统只能表达脂联素单体，不能形成三聚体、多聚体等四级结构。这些重组抗原在结构上与人体血循环中的脂联素有很大不同，使用这样的重组抗原来制备脂联素特异性抗体，会导致抗体的特异性和灵敏度都不足，从而影响到下游试剂的灵敏度和特异性。而通过哺乳动物细胞表达系统，特别是采用人胚胎肾细胞HEK293所生产的脂联素重组蛋白，不仅其三级结构与人体中的天然蛋白完全一致，并且除单体外，也能形成三聚体、六聚体及多聚体等四级结构，与人体血循环中的天然脂联素在结构上高度一致。采用该重组脂联素免疫动物产生的抗体，特别是多抗，能识别人体血循环中所有形式的脂联素；同时，采用该重组脂联素作为检测试剂的校准品，能够最准确的反映人体血循环中脂联素的水平，是作为确定脂联素正常值参考范围的最理想选择。然而目前国际上通过哺乳动物系统生产重组脂联素产量低、成本高(产量约2mg/L，专利：US7,365,170B2)，限制了该重组抗原在脂联素检测方面的推广运用。更重要的是，目前大部分对脂联素的研究例如上述专利，并没有对所生产的试剂进行详细的临床验证，未阐述测得脂联素正常水平及参考范围，未能明确脂联素异常值的范围以及测得异常值的意义，更未通过临床验证确定脂联素对2型糖尿病及糖尿病前期的预测功能，也进一步限制了脂联素检测的临床推广及运用。
技术实现思路
为解决上述现有技术存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种重组脂联素抗原、用重组脂联素抗原制备的抗体、用该抗体制备的脂联素抗体纳米胶乳颗粒、含脂联素抗体纳米乳胶颗粒的试剂盒及其在预测糖尿病前期和2型糖尿病中的应用。上述的糖尿病前期是指介乎正常和糖尿病之间的中间地带，包括空腹血糖异常(空腹血糖值介乎6.1至6.9mmol/l之间)和糖耐量异常(接受口服葡萄糖耐本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组脂联素抗原，其特征在于，其制备包括以下步骤：a.将高表达重组人全长脂联素蛋白的细胞株培养在培养基中，培养环境的二氧化碳浓度为3～6％，培养转速为100～200rpm，所述培养基为含质量百分比5～10％的牛血清的高糖DMEM培养基，培养中通氧量为0.25～0.75L/min，使细胞株达到1～3×107的细胞数；b.将所述培养基全部更换为添加了质量百分比为0.5％的维他命C的无血清培养基，使细胞株维持在1～3×107的细胞数，持续表达；优选地，还包括c.每2～3天更换一半体积的培养基，所述培养基为添加了质量百分比为0.5％的维他命C的无血清培养基；更优选地，所述重组人全长脂联素蛋白采用的表达载体骨架为pRSET A；所述通氧量为0.5L/min、所述二氧化碳的浓度为5％、所述牛血清的质量百分比为10％、所述转速为120rpm，所述持续表达的时间为4～10天，优选为7天；和/或，所述高表达为表达量10mg/L以上，优选为20mg/L以上，更优选40mg/L以上。

【技术特征摘要】
1.一种重组脂联素抗原，其特征在于，其制备包括以下步骤：a.将高表达重组人全长脂联素蛋白的细胞株培养在培养基中，培养环境的二氧化碳浓度为3～6％，培养转速为100～200rpm，所述培养基为含质量百分比5～10％的牛血清的高糖DMEM培养基，培养中通氧量为0.25～0.75L/min，使细胞株达到1～3×107的细胞数；b.将所述培养基全部更换为添加了质量百分比为0.5％的维他命C的无血清培养基，使细胞株维持在1～3×107的细胞数，持续表达；优选地，还包括c.每2～3天更换一半体积的培养基，所述培养基为添加了质量百分比为0.5％的维他命C的无血清培养基；更优选地，所述重组人全长脂联素蛋白采用的表达载体骨架为pRSETA；所述通氧量为0.5L/min、所述二氧化碳的浓度为5％、所述牛血清的质量百分比为10％、所述转速为120rpm，所述持续表达的时间为4～10天，优选为7天；和/或，所述高表达为表达量10mg/L以上，优选为20mg/L以上，更优选40mg/L以上。2.一种脂联素抗体，其特征在于，其是利用如权利要求1所述的重组脂联素抗原制备的脂联素抗体；优选为多克隆抗体；更优选地，所述多克隆抗体抗体是羊或兔多克隆抗体。3.如权利要求2所述的脂联素抗体的制备方法，其特征在于，其包括以下步骤：a.以等量弗氏完全佐剂乳化所述重组脂联素抗原，背部皮下多点注射山羊或兔；b.其后每隔1～2周以弗氏不完全佐剂乳化重组脂联素抗原，同法重复注射进行加强免疫2～4次；c.抽取血液，获得血清后纯化即得；优选地，所述兔为新西兰大白兔。4.一种脂联素抗体纳米乳胶颗粒的制备方法，其特征在于，其包括以下步骤：将胶乳颗粒溶液与如权利要求2所述的脂联素抗体混合，进行交联反应；优选地，所述胶乳颗粒为苯乙烯和丙烯酸聚合而成的聚苯乙烯微球，所述乳胶颗粒表面存在羧基基团；优选为购自Bangslab的聚苯乙烯微球；更优选地，所述乳胶颗粒的平均粒径范围为120～200nm。5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述交联使用的交联剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；所述脂联素抗体的终浓度为0.5...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐爱民，周鹏程，钟铃，赖华，
申请(专利权)人：广东英诺生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44