一种胸腺法新的合成方法技术

本发明专利技术公开了一种胸腺法新的合成方法，包括以下步骤：a、合成在侧链上有保护基的多肽片段1和多肽片段2；b、将多肽片段1的C端和多肽片段2的N端偶联，然后脱除N端保护基，得到多肽树脂Ⅰ；c、根据胸腺法新的氨基酸序列，按照从C端到N端的顺序依次逐个偶联第11个至第1个氨基酸，脱除N端保护基，再乙酰化，得到胸腺法新树脂；d、胸腺法新树脂酸解脱除C端树脂和所有保护基得到胸腺法新粗品，纯化后获得胸腺法新。本发明专利技术所述方法能够大幅度提高产品收率，缩短合成周期。

A new synthetic method of thymus method

The present invention discloses a new synthesis method of thymus method, which includes the following steps: A, polypeptide fragment 1 and polypeptide fragment 2 on the side chain, B, coupling the C end of the polypeptide 1 and the N end of the polypeptide fragment 2, and then removing the N terminal protection group, and obtaining the polypeptide resin I; C, the new amino acid sequence according to the thymus method, Eleventh to first amino acids were coupled one by one from the C end to the N end, and the N terminal protections were removed, and then the thymus method was obtained. The D, the thymic acid solution removed the C end resin and all the protective groups to get the new thymus method, and then the thymus method was obtained. The method can greatly improve the product yield and shorten the synthesis cycle.

【技术实现步骤摘要】
一种胸腺法新的合成方法
本专利技术涉及药物化学领域，具体涉及一种胸腺法新的合成方法。
技术介绍
胸腺法新是一种免疫调节因子,由28个氨基酸组成，它可以特异性地诱导T细胞Lyt1+、2+、3+表面标志的产生,促使T细胞及自然杀伤细胞(NK)的分化与成熟,促使致敏的T细胞在各种抗原或有丝分裂原激活后产生各种淋巴因子,如白介素2(IL2)、α干扰素(IFNα)、γ干扰素(IFNγ)等淋巴因子,促使对IL2高亲和力受体的表达增加,增强Th细胞的功能,同时它还通过对T4细胞的激活作用来增强异体和自体的人类混合的淋巴细胞反应。胸腺法新可能影响NK前体细胞的募集,这前体细胞暴露于干扰素后变得更有细胞毒性，使机体能有效的发挥免疫防护功能。该品具有促进T细胞分化、成熟，提高NK细胞活性，促进T细胞分泌各类淋巴因子，提高IL－2受体对IL－2的亲合力等作用。早期临床应用主要集中于抗肿瘤、免疫功能低下方面，近年来药效学研究结果同时表明，本品更具有保护肝脏、特异性地抑制受HBV感染的HepG2-Nu2细胞的生长和抑制土拨鼠WHV病毒复制的作用。在用于治疗慢性肝炎的多中心试验结果表明单独使用该品的疗效与干扰素相同，但副反应比干扰素少得多。在临床上，已成功地应用于治疗乙、丙型肝炎及其它免疫缺陷的疾病。药代动力学研究文献显示，本品健康人单次皮下注射胸腺法新1.6mg，血药峰浓度约为37.51ng/ml，达峰时间约为1.67小时，AUC0-15约为152.15ng/ml·h，半衰期约为1.65小时。一组有关Tα1药代动力学方面的由日达仙、Timosina和Tα1三种样品作对照的实验中显示，Tα1释放快速(Tmax为1-2h)，代谢缓慢(16-18h)，尽管80％由泌尿系统排出体外，但Cmax为30-80ug/L，仍比正常Tα1血浓度0.5～0.75ug/L高出几十倍。当前胸腺法新的制备方法主要为固相合成法，但由于胸腺法新分子结构中有大量的β折叠结构，形成困难序列，如逐个氨基酸从C端到N端进行接肽，从第28氨基酸偶联至第21氨基酸时，肽树脂体积就发生20％以上的收缩，同时继续接到第11氨基酸时才恢复正常，这种收缩严重降低了后续氨基酸的偶联收率，增加了分离纯化的难度，同时严重降低了产品的收率，从已报道的制备方法可知，对于98％HPLC纯度的胸腺法新，当前的制备总收率一般都在20％左右。胸腺法新的氨基酸顺序如下所示：Ac-Ser1-Asp2-Ala3-Ala4-Val5-Asp6-Thr7-Ser8-Ser9-Glu10-Ile11-Thr12-Thr13-Lys14-Asp15-Leu16-Lys17-Glu18-Lys19-Lys20-Glu21-Val22-Val23-Glu24-Glu25-Ala26-Glu27-Asn28-OH
技术实现思路
本专利技术解决上述技术问题的方案是提供一种胸腺法新的合成方法，使得本专利技术所述方法在保证产品质量的前提下，降低合成方法的复杂程度和提高产品的总收率。上述胸腺法新的合成方法，包括以下步骤：a、合成在侧链上有保护基的多肽片段1：Fmoc-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-OH；合成在侧链上有保护基的多肽片段2：NH2-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asp(α-OtBu)-氨基树脂；b、将多肽片段1的C端和多肽片段2的N端偶联，然后脱除多肽片段的N端Fmoc保护基，得到多肽树脂Ⅰ：NH2-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asp(α-OtBu)-氨基树脂；c、根据胸腺法新的氨基酸序列，按照从C端到N端的顺序依次逐个偶联第11个至第1个氨基酸，然后脱除N端保护基，再进行乙酰化反应，得到胸腺法新树脂：Ac-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asp(α-OtBu)-氨基树脂；d、胸腺法新树脂酸解脱除C端树脂和所有保护基得到胸腺法新粗品，胸腺法新粗品纯化后，获得胸腺法新。在本专利技术所述方法中，首先按照胸腺法新肽序列分成3个部分，即分成2个片段的合成以及其他氨基酸的逐个偶联，以胸腺法新主链N端到C端的氨基酸顺序编号，如下式所示：Ac-Ser1-Asp2-Ala3-Ala4-Val5-Asp6-Thr7-Ser8-Ser9-Glu10-Ile11-Thr12-Thr13-Lys14-Asp15-Leu16-Lys17-Glu18-Lys19-Lys20-Glu21-Val22-Val23-Glu24-Glu25-Ala26-Glu27-Asn28-OH多肽片段1的氨基酸序列即为上式中编号12-21的多肽序列：Fmoc-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-OH。多肽片段2的氨基酸序列即为上式中编号22-28的多肽序列：NH2-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asp(α-OtBu)-氨基树脂。作为本专利技术的优选方案，步骤a所述合成多肽片段1具体为：在偶联试剂存在下，将N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有tBu保护基的谷氨酸(Fmoc-Glu(OtBu)-OH)与载体树脂偶联，再脱Fmoc保护基得到H-Glu(OtBu)-载体树脂，然后采用活化试剂和缩合试剂，根据胸腺法新氨基酸序列，按照从C端到N端的顺序依次逐个将N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有Boc保护基的赖氨酸(Fmoc-Lys(Boc)-OH)、N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有Boc保护基的赖氨酸(Fmoc-Lys(Boc)-OH)、N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有tBu保护基的谷氨酸(Fmoc-Glu(OtBu)-OH)、N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有Boc保护基的赖氨酸(Fmoc-Lys(Boc)-OH)、N端偶联有Fmoc保护基的亮氨酸(Fmoc-Leu-OH)、N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有tBu保护基的天门冬氨酸(Fmoc-Asp(OtBu)-OH)、N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有Boc保护基的赖氨酸(Fmoc-Lys(Boc)-OH)、N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有tBu保护基的苏冬氨酸(Fmoc-Thr(tBu本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种胸腺法新的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：a、合成多肽片段1，所述多肽片段1包含胸腺法新第12‑21的氨基酸序列：Fmoc‑Thr(tBu)‑Thr(tBu)‑Lys(Boc)‑Asp(OtBu)‑Leu‑Lys(Boc)‑Glu(OtBu)‑Lys(Boc)‑Lys(Boc)‑Glu(OtBu)‑OH；所述合成多肽片段1的步骤为：Fmoc‑Glu(OtBu)‑OH在偶联试剂作用下与载体树脂偶联，脱Fmoc保护基得到H‑Glu(OtBu)‑载体树脂，在活化试剂和缩合试剂作用下，依次逐个偶联Fmoc‑Lys(Boc)‑OH、Fmoc‑Lys(Boc)‑OH、Fmoc‑Glu(OtBu)‑OH、Fmoc‑Lys(Boc)‑OH、Fmoc‑Leu‑OH、Fmoc‑Asp(OtBu)‑OH、Fmoc‑Lys(Boc)‑OH、Fmoc‑Thr(tBu)‑OH、Fmoc‑Thr(tBu)‑OH，偶联后用裂解液裂解，脱除载体树脂得到多肽片段1；合成多肽片段2，所述多肽片段2包含胸腺法新第22‑28的氨基酸序列：NH2‑Val‑Val‑Glu(OtBu)‑Glu(OtBu)‑Ala‑Glu(OtBu)‑Asp(α‑OtBu)‑氨基树脂；所述合成多肽片段2的步骤为：Fmoc‑Asp(α‑tBu)‑OH在偶联试剂作用下与脱保护后的氨基树脂偶联，脱Fmoc保护基得到H‑Asp(α‑tBu)‑氨基树脂，在活化试剂和缩合试剂作用下依次逐个偶联Fmoc‑Glu(OtBu)‑OH、Fmoc‑Ala‑OH、Fmoc‑Glu(OtBu)‑OH、Fmoc‑Glu(OtBu)‑OH、Fmoc‑Val‑OH、Fmoc‑Val‑OH，脱除N端Fmoc保护基得到多肽片段2；b、多肽片段1的C端和多肽片段2的N端偶联，脱除多肽片段N端Fmoc保护基，得到多肽树脂Ⅰ：NH2‑Thr(tBu)‑Thr(tBu)‑Lys(Boc)‑Asp(OtBu)‑Leu‑Lys(Boc)‑Glu(OtBu)‑Lys(Boc)‑Lys(Boc)‑Glu(OtBu)‑Val‑Val‑Glu(OtBu)‑Glu(OtBu)‑Ala‑Glu(OtBu)‑Asp(α‑OtBu)‑氨基树脂；c、步骤b获得的多肽树脂1，在活化试剂和缩合试剂作用下将Fmoc‑Ile‑OH的C端与多肽树脂Ⅰ的N端偶联后，脱Fmoc保护基得到H‑Ile‑多肽树脂Ⅰ，依次逐个偶联Fmoc‑Glu(OtBu)‑OH、Fmoc‑Ser(tBu)‑OH、Fmoc‑Ser(tBu)‑OH、Fmoc‑Thr(tBu)‑OH、Fmoc‑Asp(OtBu)‑OH、Fmoc‑Val‑OH、Fmoc‑Aal‑OH、Fmoc‑Aal‑OH、Fmoc‑Asp(OtBu)‑OH、Fmoc‑Ser(tBu)‑OH，偶联后脱除N端Fmoc保护基，乙酰化反应后得到胸腺法新树脂：Ac‑Ser(tBu)‑Asp(OtBu)‑Ala‑Ala‑Val‑Asp(OtBu)‑Thr(tBu)‑Ser(tBu)‑Ser(tBu)‑Glu(OtBu)‑Ile‑Thr(tBu)‑Thr(tBu)‑Lys(Boc)‑Asp(OtBu)‑Leu‑Lys(Boc)‑Glu(OtBu)‑Lys(Boc)‑Lys(Boc)‑Glu(OtBu)‑Val‑Val‑Glu(OtBu)‑Glu(OtBu)‑Ala‑Glu(OtBu)‑Asp(α‑OtBu)‑氨基树脂；d、胸腺法新树脂酸解脱除树脂和所有保护基得到胸腺法新粗品，纯化后获得胸腺法新，所述纯化具体为：胸腺法新粗品，加水搅拌，用氨水调pH7.0至完全溶解，溶液用0.45μm微孔滤膜过滤，纯化备用；采用高效液相色谱法进行纯化，得胸腺法新纯化中间体浓缩液；取胸腺法新纯化中间体浓缩液，用0.45μm滤膜滤过备用；采用高效液相色谱法进行换盐，合并换盐主峰溶液，减压浓缩，得到胸腺法新醋酸水溶液，冷冻干燥，得胸腺法新纯品。...

【技术特征摘要】
1.一种胸腺法新的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：a、合成多肽片段1，所述多肽片段1包含胸腺法新第12-21的氨基酸序列：Fmoc-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-OH；所述合成多肽片段1的步骤为：Fmoc-Glu(OtBu)-OH在偶联试剂作用下与载体树脂偶联，脱Fmoc保护基得到H-Glu(OtBu)-载体树脂，在活化试剂和缩合试剂作用下，依次逐个偶联Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH，偶联后用裂解液裂解，脱除载体树脂得到多肽片段1；合成多肽片段2，所述多肽片段2包含胸腺法新第22-28的氨基酸序列：NH2-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asp(α-OtBu)-氨基树脂；所述合成多肽片段2的步骤为：Fmoc-Asp(α-tBu)-OH在偶联试剂作用下与脱保护后的氨基树脂偶联，脱Fmoc保护基得到H-Asp(α-tBu)-氨基树脂，在活化试剂和缩合试剂作用下依次逐个偶联Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Val-OH，脱除N端Fmoc保护基得到多肽片段2；b、多肽片段1的C端和多肽片段2的N端偶联，脱除多肽片段N端Fmoc保护基，得到多肽树脂Ⅰ：NH2-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asp(α-OtBu)-氨基树脂；c、步骤b获得的多肽树脂1，在活化试剂和缩合试剂作用下将Fmoc-Ile-OH的C端与多肽树脂Ⅰ的N端偶联后，脱Fmoc保护基得到H-Ile-多肽树脂Ⅰ，依次逐个偶联Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Aal-OH、Fmoc-Aal-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH，偶联后脱除N端Fmoc保护基，乙酰化反应后得到胸腺法新树脂：Ac-...

【专利技术属性】
技术研发人员：文永均，
申请(专利权)人：成都圣诺生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：四川,51