用于肿瘤融合基因EWS-FLI1检测的引物对、探针、试剂盒及其两步检测法制造技术

本发明专利技术提出一种用于肿瘤融合基因EWS‑FLI1检测的引物对、探针、试剂盒及其两步检测法，属于基因工程技术领域，能够解决现有的对于融合基因EWS‑FLI1的检测操作繁琐、结果判读耗时且存在主观误差等技术问题。该用于肿瘤融合基因EWS‑FLI1检测的引物对包括：用于融合基因EWS‑FLI1 I型融合的如SEQ No.1序列所示的正向引物EWS_F、如SEQ No.2序列所示的反向引物FLI1_Exon 7&8 R；和用于融合基因EWS‑FLI1 II型融合的如SEQ No.1序列所示的正向引物EWS_F、如SEQ No.4序列所示的反向引物FLI1_Exon 6&7R。本发明专利技术能够应用于EWS‑FLI1融合基因的定量检测中，进而有效用于尤文肉瘤家族肿瘤的检测中。

Primer pairs, probes, kits and two step detection methods for tumor fusion gene EWS-FLI1 detection

The invention provides a primer pair, probe, kit and two-step detection method for detecting tumor fusion gene EWS FLI1. The method belongs to the field of genetic engineering technology, and can solve the existing technical problems of tedious detection operation for fusion gene EWS FLI1, time-consuming result interpretation and subjective error. The primer pairs used for detection of tumor fusion gene EWS_FLI1 include: forward primers EWS_F as shown in SEQ No.1 sequence, reverse primers FLI1_Exon 7&8 R as shown in SEQ No.2 sequence, and forward primers as shown in SEQ No.1 sequence for fusion of fusion gene EWS_FLI1 type II. EWS_F, as shown in the SEQ No.4 sequence, is a reverse primer FLI1_Exon 6&7R. The invention can be applied to the quantitative detection of EWS FLI1 fusion gene, and can be effectively used for the detection of Ewing sarcoma family tumor.

【技术实现步骤摘要】
用于肿瘤融合基因EWS-FLI1检测的引物对、探针、试剂盒及其两步检测法
本专利技术属于基因工程
，尤其涉及一种用于肿瘤融合基因EWS-FLI1检测的引物对、探针、试剂盒及其两步检测法。
技术介绍
尤文肉瘤家族肿瘤(Ewingsarcomafamilyoftumors，ESFT)是一组低分化且高度恶性的小圆细胞肿瘤，包括尤文肉瘤(Ewingsarcoma，ES)、Askin瘤和原始神经外胚层肿瘤(primitiveneurotodermaltumour，PNET)。患者中位年龄为15岁，超过半数患者为青少年。每年15岁以下儿童的ESFT发病率为3人/百万人，且诊断时发现已伴有肺、骨等其他部位转移的患者约占30％。目前，在ESFT患者中发现了7种染色体易位现象，而t(11；22)(q24；q12)易位，即位于11号染色体q24上的FLI1基因与22号染色体上的EWS基因发生融合,产生的融合蛋白EWS-FLI1约占ESFT染色体易位的85％。染色体断裂位点不同可以产生不同的融合亚型，通常单个ESFT患者中只表达一种亚型。目前已经发现EWS-FLI1有12种不同的融合亚型，其中最常见的2种亚型是EWS基因的7号外显子分别与FLI1基因的7号外显子(Ⅰ型融合)和6号外显子(Ⅱ型融合)(根据人类基因组参考hg38)组成，各占整个EWS-FLI1融合基因比例的60％和25％。EWS基因位于22号染色体上，由17个外显子组成，编码一种多功能蛋白。EWS蛋白的5’氨基末端是转录引导区域，3’羧基末端是RNA结合区，在基因表达、细胞信号调节以及RNA的加工处理和运输等方面发挥重要作用。FLI1基因位于11号染色体上，由9个外显子组成，编码一种转录因子。FLI1蛋白5’氨基末端是转录活性区域，3’羧基末端是DNA结合区，主要功能是在促进细胞增殖和肿瘤发生等方面。融合蛋白EWS-FLI1是EWS的5’端与FLI1的3’端发生融合，形成了由EWS转录活性区与FLI1的DNA结合区反常连接的融合蛋白。融合蛋白EWS-FLI1没有稳定的结构，5’端相对有序，主要由螺旋-转角-螺旋构成；而3’端含有多个芳香族氨基酸残基的重复多肽，构成了EWS-FLI1的无序区域，这种无序结构有利于与其他转录因子的结合和分离。目前在临床上,对EWS-FLI1融合基因的检测主要是运用探针荧光原位杂交技术(FISH)，特异性的检测出尤文氏肉瘤相关基因EWSR1基因的断裂分离情况，从而为尤文氏肉瘤的临床诊断提供辅助判断依据。但是FISH检测耗时长、探针成本较为昂贵且需要经过专业培训的技术人员进行较为繁琐的操作、结果判读耗时且存在主观误差等。
技术实现思路
本专利技术提出一种用于肿瘤融合基因EWS-FLI1检测的引物对、探针、试剂盒及其两步检测法，利用该试剂盒可实现对融合基因EWS-FLI1的检测，操作方法较为简便，且检测结果客观准确。为了达到上述目的，本专利技术提供了一种用于肿瘤融合基因EWS-FLI1检测的引物对，包括：用于融合基因EWS-FLI1I型融合的如SEQNo.1序列所示的正向引物EWS_F、如SEQNo.2序列所示的反向引物FLI1_Exon7&8R；和用于融合基因EWS-FLI1II型融合的如SEQNo.1序列所示的正向引物EWS_F、如SEQNo.4序列所示的反向引物FLI1_Exon6&7R。本专利技术还提供了一种用于肿瘤融合基因EWS-FLI1检测的探针，包括：用于融合基因EWS-FLI1I型融合的如SEQNo.3序列所示的探针PRFAM7&7R以及用于融合基因EWS-FLI1II型融合的如SEQNo.5序列所示的探针PRCy7&6，其中所述探针带有发光基团，所述发光基团为FAM或Cy。本专利技术提供了一种用于肿瘤融合基因EWS-FLI1检测的试剂盒，包括如上述技术方案所述的引物对和如上述技术方案所述的探针。本专利技术还提供了一种利用如上述任一项技术方案所述的试剂盒对肿瘤融合基因EWS-FLI1进行的两步检测法，包括以下步骤：从肿瘤组织中提取TotalRNA,对其进行反转录，得到反转录产物cDNA；利用试剂盒中对应的正向引物、反向引物和探针分别制备反转录产物的EWS-FLI1I型融合的PCR反应液和EWS-FLI1II型融合的PCR反应液，同时制备各自的阴性对照的PCR反应液；对上述三种PCR反应液分别进行TaqMan探针定量PCR反应，得到反转录产物中EWS-FLI1I型融合和EWS-FLI1II型融合的循环交叉点。作为优选，对样品进行反转录包括以下步骤：利用所述样品配制RNA-PrimerMix，混匀后进行短暂离心，于65℃将RNA变性5min后立即放置冰上；利用RNA变性后的RNA-PrimerMix配制反转录反应液，混匀后短暂离心，于50℃孵育1h；待孵育结束后，70℃灭活处理15min，最后-20℃保存反转录产物。作为优选，利用所述样品配制RNA-PrimerMix包括在预冷的RNasefree的反应管内加入以下试剂至总体积13μl，具体为：作为优选，利用RNA变性后的RNA-PrimerMix配制反转录反应液包括在RNA-PrimerMix反应管内加入以下试剂至总体积20μl，具体为：作为优选，反转录产物的EWS-FLI1I型融合的PCR反应液具体配制如下：作为优选，反转录产物的EWS-FLI1II型融合的PCR反应液具体配制如下：作为优选，PCR反应具体如下：95℃预变性10min；然后40个循环,95℃变性10sec，60℃退火30sec后，72℃延伸1sec；最后再40℃冷却10sec。与现有技术相比，本专利技术的优点和积极效果在于：本专利技术提供了一种用于肿瘤融合基因EWS-FLI1检测的试剂盒，该试剂盒中包含有分别用于检测EWS-FLI1I型融合和II型融合的正向引物、反向引物和探针，其可有针对性的对其进行检测。结合两步法RT-qPCR可实现对融合基因EWS-FLI1的定量检测，操作方法较为简便，且检测结果客观准确。附图说明图1为本专利技术实施例所提供的A673cDNA和Z63cDNA的含量检测图；图2为本专利技术实施例所提供的Z63肿瘤TotalRNAQC结果图。具体实施方式下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例1材料说明：模板cDNA:本实施例提供的样本为从肿瘤组织或细胞中提取的TotalRNA反转录而成的cDNA，但由于尤文肉瘤的发病率很低,极难得到样品,因此，本实施例中使用尤文肉瘤细胞系A673（CRL-1598)的cDNA作为I型融合的阳性对照、尤文肉瘤病患Z63的肿瘤cDNA作为II型融合的阳性对照进行说明。1、样品反转录反转录采用ThermoFisherSuperScriptIIIReverseTranscriptase试剂盒，具体步骤包括：1)融解反应所需的试剂，上下轻微颠倒混匀，进行短暂离心后放置冰上待用；2)在冰上配制RNA-PrimerMix：在预冷的RNasefree的反应管内加入本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于肿瘤融合基因EWS‑FLI1检测的引物对，其特征在于，包括：用于融合基因EWS‑FLI1 I型融合的如SEQ No.1序列所示的正向引物EWS_F、如SEQ No.2序列所示的反向引物FLI1_Exon 7&8 R；和用于融合基因EWS‑FLI1 II型融合的如SEQ No.1序列所示的正向引物EWS_F、如SEQ No.4序列所示的反向引物FLI1_Exon 6&7 R。

【技术特征摘要】
1.一种用于肿瘤融合基因EWS-FLI1检测的引物对，其特征在于，包括：用于融合基因EWS-FLI1I型融合的如SEQNo.1序列所示的正向引物EWS_F、如SEQNo.2序列所示的反向引物FLI1_Exon7&8R；和用于融合基因EWS-FLI1II型融合的如SEQNo.1序列所示的正向引物EWS_F、如SEQNo.4序列所示的反向引物FLI1_Exon6&7R。2.一种用于肿瘤融合基因EWS-FLI1检测的探针，其特征在于，包括：用于融合基因EWS-FLI1I型融合的如SEQNo.3序列所示的探针PRFAM7&7R以及用于融合基因EWS-FLI1II型融合的如SEQNo.5序列所示的探针PRCy7&6，其中所述探针带有发光基团，所述发光基团为FAM或Cy。3.一种用于肿瘤融合基因EWS-FLI1检测的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的引物对和如权利要求2所述的探针。4.一种利用如权利要求3所述的试剂盒对肿瘤融合基因EWS-FLI1进行的两步检测法，其特征在于，包括以下步骤：从肿瘤组织中提取TotalRNA,对其进行反转录，得到反转录产物cDNA；利用试剂盒中对应的正向引物、反向引物和探针分别配制反转录产物的EWS-FLI1I型融合的PCR反应液和EWS-FLI1II型融合的PCR反应液，同时配制各自的阴性对照的PCR反应液；对上述三种PCR反应液分别进行TaqMan...

【专利技术属性】
技术研发人员：姚斐，宫小明，孔彩霞，华萌萌，
申请(专利权)人：青岛普泽麦迪生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37