使用超低量总RNA的多文库混样测序方法技术

本发明专利技术公开了一种使用超低量总RNA的多文库混样测序方法，属于生物技术和分子生物学领域，具体包括以下步骤：微量样本总RNA的提取、起始总RNA的反转录和扩增富集、测序库的建立、利用MinlON纳米孔测序仪进行cDNA测序。本发明专利技术提供的测序方法所需最低起始量的样本核酸量可低至10pg‑10ng，相当于1‑1000个单细胞的核酸量，能够实现那些获取大量总RNA困难的稀有样本测序，在稀有样本和特殊样本等多个测序领域具有广阔的应用前景。

Mixed sample sequencing of multi library using ultra low total RNA

【技术实现步骤摘要】
使用超低量总RNA的多文库混样测序方法
本专利技术属于生物技术和分子生物学领域，尤其涉及一种使用超低量总RNA的多文库混样测序方法。
技术介绍
目前，以Illumina为代表的第二代测序平台测得的短读长仅能覆盖转录本的长度，且存在难以实现依赖计算重构准确的异构体等缺陷，因此纳米孔测序技术，又称第三代或第四代测序技术应运而生。使用纳米孔测序技术不仅没有读长上限的限制，还能实现对整个转录本进行单读长的端到端测序，真正实现了简单、准确的组装并能对高度相似的异构体进行区分，所以新一代的纳米孔测序技术已经成为研究RNA测序的一种新的且更为有效的方式。目前，RNA测序技术对样本的起始RNA量要求较高，对于那些无法达到最低上样量的样本是无法进行测序分析的，但在许多情况下，例如在生殖发育生物学、干细胞、癌症、考古学、临床诊断等多个研究领域中，都无法获得足够上样数量的总RNA。因为上述研究中均涉及微量且稀有的样本，无法满足目前RNA测序技术中对起始RNA量的需求，这无疑成为阻碍RNA测序这项新技术的进一步应用与发展，因此，本领域迫切需要在传统RNA测序方法的技术之上建立一种针对微量样本的RNA测序方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种使用超低量总RNA的多文库混样测序方法，该测序方法是将超低量总RNA反转录成cDNA，并将cDNA扩增后连接上不同的条码，然后利用MinlON进行测序，该方法不仅能对低于1ng的总RNA进行测序，还可将不同的总RNA混合在一起共同测序。为了达到上述目的，本专利技术采用的技术方案为：使用超低量总RNA的多文库混样测序方法，所述方法包括以下步骤：提取微量样本总RNA，将提取的样本总RNA作为起始总RNA，其中所述起始总RNA的核酸量为10pg-10ng；将起始总RNA的进行反转录和扩增富集，并对扩增富集后的cDNA进行浓度和质量检测，至cDNA的含量达到50-1000ng；利用扩增富集后cDNA建立测序库，然后将所述测序库作为待测样品，并用MinlON纳米孔测序仪进行测序。作为优选，所述微量样本包括单细胞检测样本和多细胞检测样本。作为优选，所述测序库的建立具体包括以下步骤：利用末端修复酶处理所述cDNA，通过末端修复反应，得到末端修复cDNA；在所述末端修复cDNA上通过第一次连接反应连接条码，得到条码-末端修复cDNA后，利用磁珠纯化、回收所述条码-末端修复cDNA，得到纯化后的条码-末端修复cDNA，至检测其回收量≥50ng；将纯化并检测后的条码-末端修复cDNA混合后，在连接酶的作用下，通过第二次连接反应与测序接头连接，得到连接测序接头的条码-末端修复cDNA；利用磁珠纯化、回收所述测序连接接头的条码-末端修复cDNA，得到纯化后的连接测序接头的条码-末端修复cDNA，并检测其回收量≥100ng时，建立得到测序库。作为优选，所述末端修复反应的反应体系为：扩增富集后的cDNA50μl、反应缓冲液7μl、末端修复酶3μl，共计60μl；反应条件为：在20℃条件下反应30min，然后在65℃条件下反应30min。作为优选，所述第一次连接反应的反应条件为20℃条件下反应1-2h。作为优选，所述第一次连接反应的反应体系为：利用末端修复酶处理所述cDNA反应结束后，向该反应体系中加入连接预混液30μl、条码2.5μl、连接增强剂1μl和无酶水6.5μl，共计100μl。作为优选，所述第二次连接反应的反应条件为20℃条件下反应1-2h。作为优选，所述第二次连接反应的反应体系为：所述纯化后的条码-末端修复cDNA65μl、测序接头预混液5μl、连接反应缓冲液20μl和DNA连接酶10μl，共计100μl。作为优选，利用QubitDNAHSAssay检测纯化后的条码-末端修复cDNA和纯化后的连接测序接头的条码-末端修复cDNA的回收量。与现有技术相比，本专利技术的优点和积极效果在于：本专利技术提供的使用超低量总RNA的多文库混样测序方法，有以下优点：(1)对样品的需求量小，仅需要10pg-10ng的起始总RNA，相当于1个至1000个细胞的总RNA，能够实现那些难以获得大量总RNA的稀有样本的测序工作；(2)可将不同的总RNA混合在一起进行测序工作。附图说明图1为本专利技术实施例所提供的流程图；图2为本专利技术实施例所提供的扩增后cDNA质量和浓度检测图。具体实施方式下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。本专利技术实施例提供了一种使用超低量总RNA的多文库混样测序方法，所述方法包括以下步骤：提取微量样本总RNA，将提取的样本总RNA作为起始总RNA，其中所述起始总RNA的核酸量为10pg-10ng；将起始总RNA的进行反转录和扩增富集，并对扩增富集后的cDNA进行浓度和质量检测，至cDNA的含量达到50-1000ng；利用扩增富集后cDNA建立测序库，然后将所述测序库作为待测样品，并用MinlON纳米孔测序仪进行测序。在一优选实施例中，所述微量样本包括单细胞检测样本和多细胞检测样本。在一优选实施例中，所述测序库的建立具体包括以下步骤：利用末端修复酶处理所述cDNA，通过末端修复反应，得到末端修复cDNA；在所述末端修复cDNA上通过第一次连接反应连接条码，得到条码-末端修复cDNA后，利用磁珠纯化、回收所述条码-末端修复cDNA，得到纯化后的条码-末端修复cDNA，至检测其回收量≥50ng；将纯化并检测后的条码-末端修复cDNA混合后，在连接酶的作用下，通过第二次连接反应与测序接头连接，得到连接测序接头的条码-末端修复cDNA；利用磁珠纯化、回收所述连接测序接头的条码-末端修复cDNA，得到纯化后的连接测序接头的条码-末端修复cDNA，并检测其回收量≥100ng时，建立得到测序库。在一优选实施例中，所述末端修复反应的反应体系为：扩增富集后的cDNA50μl、反应缓冲液7μl、末端修复酶3μl，共计60μl；反应条件为：在20℃条件下反应30min，然后在65℃条件下反应30min。在一优选实施例中，所述第一次连接反应的反应条件为20℃条件下反应1-2h。在一优选实施例中，所述第一次连接反应的反应体系为：利用末端修复酶处理所述cDNA反应结束后，向该反应体系中加入连接预混液30μl、条码2.5μl、连接增强剂1μl和无酶水6.5μl，共计100μl。在一优选实施例中，所述第二次连接反应的反应条件为20℃条件下反应1-2h。在一优选实施例中，所述第二次连接反应的反应体系为：所述纯化后的条码-末端修复cD本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.使用超低量总RNA的多文库混样测序方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：/n提取微量样本总RNA，将提取的样本总RNA作为起始总RNA，其中所述起始总RNA的核酸量为10pg-10ng；/n将起始总RNA的进行反转录和扩增富集，并对扩增富集后的cDNA进行浓度和质量检测，至cDNA的含量达到50-1000ng；/n利用扩增富集后cDNA建立测序库，然后将所述测序库作为待测样品，并用MinlON纳米孔测序仪进行测序。/n

【技术特征摘要】
1.使用超低量总RNA的多文库混样测序方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
提取微量样本总RNA，将提取的样本总RNA作为起始总RNA，其中所述起始总RNA的核酸量为10pg-10ng；
将起始总RNA的进行反转录和扩增富集，并对扩增富集后的cDNA进行浓度和质量检测，至cDNA的含量达到50-1000ng；
利用扩增富集后cDNA建立测序库，然后将所述测序库作为待测样品，并用MinlON纳米孔测序仪进行测序。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微量样本包括单细胞检测样本和多细胞检测样本。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述建立测序库，具体包括以下步骤：
利用末端修复酶处理所述cDNA，通过末端修复反应，得到末端修复cDNA；
在所述末端修复cDNA上通过第一次连接反应连接不同条码，得到条码-末端修复cDNA后，利用磁珠纯化、回收所述条码-末端修复cDNA，得到纯化后的条码-末端修复cDNA，至检测其回收量≥50ng；
将纯化并检测后的条码-末端修复cDNA混合后，在连接酶的作用下，通过第二次连接反应与测序接头连接，得到连接测序接头的条码-末端修复cDNA；
利用磁珠纯化、回收所述测序连接接头的条码-末端修复cDNA，得到纯化后的连接测序接头的条码-末端修复cDNA，并检测其回收量...

【专利技术属性】
技术研发人员：姚斐，
申请(专利权)人：青岛普泽麦迪生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37