使用低量总RNA的直接测序方法技术

本发明专利技术公开了一种使用低量总RNA的直接测序方法，属于生物技术和分子生物学领域，包括以下步骤：微量样本总RNA的提取及其质量检测、起始总RNA的反转录和扩增富集、利用纳米孔测序仪进行RNA直接测序。本发明专利技术提供的测序方法无需进行mRNA纯化，或是将rRNA去除，节约实验时间和成本，所需最低起始量的样本核酸量可低至1‑3μg，能够实现那些获取大量总RNA困难的稀有样本测序，在稀有样本和特殊样本等多个测序领域具有广阔的应用前景。

Direct sequencing using low total RNA

【技术实现步骤摘要】
使用低量总RNA的直接测序方法
本专利技术属于生物技术和分子生物学领域，尤其涉及一种使用低量总RNA的直接测序方法。
技术介绍
目前，以Illumina为代表的第二代测序平台测得的短读长仅能覆盖转录本的长度，因此依赖计算重构准确的异构体组装非常困难，同时短读长也表现出高比率的多重定位，因此纳米孔测序技术，又称第三代或第四代测序技术应运而生。使用纳米孔测序技术不仅没有读长上限的限制，还能实现对整个转录本进行单读长的端到端测序，真正实现了简单、准确的组装并能对高度相似的异构体进行区分，所以新一代的纳米孔测序技术已经成为研究RNA直接测序的一种新的且更为有效的方式。目前，RNA直接测序技术对样本的起始RNA量要求较高，对于那些无法达到最低上样量的样本是无法进行测序分析的，但在许多情况下，例如在生殖发育生物学、干细胞、癌症、考古学、临床诊断等多个研究领域中，都无法获得足够上样数量的总RNA。因为上述研究中均涉及微量且稀有的样本，无法满足目前RNA直接测序的基本RNA量的需求，这无疑阻碍了RNA直接测序这项新技术的进一步应用与发展，因此，本领域迫切需要在传统RNA直接测序方法的技术之上建立一种针对微量样本的RNA直接测序方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种使用低量总RNA的直接测序方法，该方法无需进行mRNA纯化，或是将rRNA去除，而是直接使用总RNA进行测序的方法，同时对样本总RNA的需求量小，仅需要1-3μg的起始总RNA即可，能实现那些难以获得较大样本量样品的测序工作。为了达到上述目的，本专利技术采用的技术方案为：一种使用低量总RNA的直接测序方法，所述方法包括以下步骤：提取微量样本总RNA并进行质量检测，将提取的样本总RNA作为起始总RNA，其中所述起始总RNA的核酸量为1-3μg；将起始总RNA进行反转录和扩增富集后得到cDNA，并对所述cDNA进行浓度和质量检测；利用所述cDNA建立测序库，然后将所述测序库作为待测样品，并用纳米孔测序仪进行测序。作为优选，所述微量样本包括细胞样本和组织样本。作为优选，所述细胞样本包括人类大肠癌细胞和骨髓瘤细胞，组织样本包括尤文肉瘤组织。作为优选，所述起始总RNA进行扩增富集采用如下步骤：在所述起始总RNA上通过第一次连接反应连接反转接头，得到反转接头-RNA；所述反转接头-RNA在超级反转录酶的作用下进行反转录反应，得到cDNA，然后利用磁珠纯化所述cDNA，得到纯化后的cDNA；所述纯化后的cDNA通过第二次连接反应连接RNA测序接头，得到测序接头-cDNA，然后利用磁珠纯化所述测序接头-cDNA，得到纯化后的测序接头-cDNA，并检测所述测序接头-cDNA的回收量＞500ng。作为优选，所述第一次连接反应的反应条件为20-25℃反应1-1.5h。作为优选，所述第一次连接反应的反应体系为：起始总RNA7.5μl、连接反应缓冲液3.0μl、反转接头2.0μl、DNA连接酶2.0μl、RNA标准链0.5μl，共计15.0μl。作为优选，所述反转录反应的反应体系为：向完成所述第一次连接反应的体系中加入无酶水9.0μl、dNTPs2.0μl、反应缓冲液8.0μl、DTT4.0μl、超级反转录酶2.0μl；所述反转录反应的反应条件为50℃，50min；70℃，10min，4℃，保持。作为优选，所述第二次连接反应的反应条件为20-25℃反应1-1.5h。作为优选，所述第二次连接反应的反应体系为：cDNA20.0μl、连接反应缓冲液8.0μl、测序接头6.0μl、DNA连接酶3.0μl、无酶水3.0μl，共计40.0μl。作为优选，利用QubitDNAHSAssay检测纯化后的测序接头-cDNA的回收量。与现有技术相比，本专利技术的优点和积极效果在于：本专利技术提供的使用低量总RNA的直接测序方法，有以下优点：(1)无需进行mRNA纯化，或是将rRNA去除，节约实验时间和成本；(2)对样品的需求量小，仅需要1-3μg的起始总RNA，能够实现那些难以获得大量总RNA的稀有样本的测序工作；(3)利用该测序方法得出的测序结果与现有技术中RNA直接测序方法推荐的起始总RNA使用量测得的结果无明显差异。附图说明图1为本专利技术实施例所提供的使用低量总RNA的直接测序方法流程图；图2为本专利技术实施例所提供的总RNA的质量检测结果图；图3为本专利技术实施例所提供的RT-PCR结果图。具体实施方式下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。本专利技术实施例提供了一种使用低量总RNA的直接测序方法，所述方法包括以下步骤：提取微量样本总RNA并进行质量检测，将提取的样本总RNA作为起始总RNA，其中所述起始总RNA的核酸量为1-3μg；将起始总RNA进行反转录和扩增富集后得到cDNA，并对所述cDNA进行浓度和质量检测；利用所述cDNA建立测序库，然后将所述测序库作为待测样品，并用纳米孔测序仪进行测序。在一优选实施例中，所述微量样本包括细胞样本和组织样本。在一优选实施例中，所述细胞样本包括人类大肠癌细胞和骨髓瘤细胞，组织样本包括尤文肉瘤组织。在一优选实施例中，所述起始总RNA进行扩增富集采用如下步骤：在所述起始总RNA上通过第一次连接反应连接反转接头，得到反转接头-RNA；所述反转接头-RNA在超级反转录酶的作用下进行反转录反应，得到cDNA，然后利用磁珠纯化所述cDNA，得到纯化后的cDNA；所述纯化后的cDNA通过第二次连接反应连接RNA测序接头，得到测序接头-cDNA，然后利用磁珠纯化所述测序接头-cDNA，得到纯化后的测序接头-cDNA，并检测所述测序接头-cDNA的回收量＞500ng。在一优选实施例中，所述第一次连接反应的反应条件为20-25℃反应1-1.5h。在上述优选实施例中，将第一次连接反应的反应时长限定在1-1.5h的原因在于：由于起始RNA的含量过低，为了使其最大限度的连接上反转序接头，如果反应时间过短，会直接影响到最终的检测结果。在一优选实施例中，所述第一次连接反应的反应体系为：起始总RNA7.5μl、连接反应缓冲液3.0μl、反转接头2.0μl、DNA连接酶2.0μl、RNA标准链0.5μl，共计15.0μl。在一优选实施例中，所述反转录反应的反应体系为：向完成所述第一次连接反应的体系中加入无酶水9.0μl、dNTPs2.0μl、反应缓冲液8.0μl、DTT4.0μl、超级反转录酶2.0μl；所述反转录反应的反应条件为50℃，50min；70℃，10min，4℃，保持。在一本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.使用低量总RNA的直接测序方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：/n提取微量样本总RNA并进行质量检测，将提取的样本总RNA作为起始总RNA，其中所述起始总RNA的核酸量为1-3μg；/n将起始总RNA进行反转录和扩增富集后得到cDNA，并对所述cDNA进行浓度和质量检测；/n利用所述cDNA建立测序库，然后将所述测序库作为待测样品，并用纳米孔测序仪进行测序。/n

【技术特征摘要】
1.使用低量总RNA的直接测序方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
提取微量样本总RNA并进行质量检测，将提取的样本总RNA作为起始总RNA，其中所述起始总RNA的核酸量为1-3μg；
将起始总RNA进行反转录和扩增富集后得到cDNA，并对所述cDNA进行浓度和质量检测；
利用所述cDNA建立测序库，然后将所述测序库作为待测样品，并用纳米孔测序仪进行测序。


2.根据权利要求1所述的测序方法，其特征在于，所述微量样本包括细胞样本和组织样本。


3.根据权利要求1所述的测序方法，其特征在于，所述细胞样本包括人类大肠癌细胞和骨髓瘤细胞，组织样本包括尤文肉瘤组织。


4.根据权利要求1所述的测序方法，其特征在于，所述起始总RNA进行反转录和扩增富集采用如下步骤：
在所述起始总RNA上通过第一次连接反应连接反转接头，得到反转接头-RNA；
所述反转接头-RNA在超级反转录酶的作用下进行反转录反应，得到cDNA，然后利用磁珠纯化所述cDNA，得到纯化后的cDNA；
所述纯化后的cDNA通过第二次连接反应连接RNA测序接头，得到测序接头-cDNA，然后利用磁珠纯化所述测序接头-cDNA，得到纯化后的测序接头-cDNA，并检测所述测序接头-cDNA的回收量＞500ng。

【专利技术属性】
技术研发人员：姚斐，
申请(专利权)人：青岛普泽麦迪生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37