全流程质控的病原微生物高通量测序检测方法技术

本发明专利技术提供了全流程质控的病原微生物高通量测序检测方法，包括：在第一待检测微生物样品中加入内参，得到第二待检测微生物样品；分别提取第二待检测微生物样品、预先设定的阳性对照样本和空白对照样本中的DNA；采用病原微生物检测试剂盒分别对提取的DNA样本构建测序文库；基于二代测序平台对测序文库进行测序，并对测序结果中的原始测序数据进行质控处理，并去除比对到宿主基因组的序列，获得待比对数据；基于预先建立的比对数据库，对待比对数据进行比对，根据比对结果，确定主要病原微生物，实现针对感染性疾病的无需预知、无偏好、高通量的病原微生物的快速临床检测，同时实现系统的全流程质控，并降低假阳性。

High throughput sequencing of pathogenic microorganisms for quality control

【技术实现步骤摘要】
全流程质控的病原微生物高通量测序检测方法
本专利技术涉及感染性疾病临床检测
，特别涉及全流程质控的病原微生物高通量测序检测方法。
技术介绍
感染性疾病病原微生物的传统诊断技术包括镜检、培养、血清学方法等。镜检的敏感性较低，除非样本属高疾病负荷，并且特异性不强。培养的敏感性因病原体而异，尤其是一些所需营养复杂的难培养的微生物，如隐球菌等最常见的3种神经侵袭性真菌可以在标准的、敏感性可变的细菌培养基上培养，至于更多的罕见真菌，则需要特定的培养基；如单纯疱疹病毒仅能从至多5％的单纯疱疹病毒脑炎病例脑脊液中培养出来，且抗生素治疗也会影响培养的敏感性。此外，此方法所需的时间较长，细菌培养至少需要3～5天，用细胞系培养病毒可能需要30天。血清学方法在感染早期的诊断中敏感性不高，会出现体液免疫缺陷的假阴性。聚合酶链式反应(PCR)及其衍生技术是基于特定靶点的有限微生物的检测，且与上述传统诊断技术相似，依赖于对病原微生物的先验认知，且只局限于微生物基因组的一小部分。利用综合的传统诊断技术，仅能在小部分的病例中实现病原微生物检测。宏基因组二代测序(Metagenomicnext-generationsequencing，mNGS)为感染性疾病的病原微生物诊断提供了一种无需预知、无偏好、高通量的方法。不需要对病原体进行培养，不依赖于临床预测因素或实验室检测结果，可直接从患者的脑脊液、血液、胸水、腹水、肺泡灌洗液等样本中提取核酸，可以在短时间内一次性检测样本中几乎所有潜在的病原体(病毒、细菌、真菌和寄生虫)，包括新发病原体，具有良好的敏感性和特异性。临床宏基因组学的实施，特别强调质量控制和质量保证。由于mNGS检测病原微生物涉及核酸提取、文库构建、上机测序流程的多个实验步骤，因此需要对其整个流程进行严格质控以确保检测结果的可靠性和准确性。mNGS检测病原微生物的临床实施需要设置以下质控：1)如以DNA序列、特定生物体等作为内参，可以质控待检测微生物样品的全流程实验是否成功，若无内参，则很难判断某个样本的阴性结果是否是由于该样本实验失败导致的；2)以多个已知微生物组成的样本作为阳性对照，可用于监控整批待检测微生物样品的核酸提取、文库构建、上机测序、信息分析的过程，若无已知的阳性对照样本与待检测微生物样品同步实施整个实验与分析流程，则无法评估整个检测流程的成功与否；3)空白对照或阴性对照用于监控外源的或试剂的微生物污染和跨样本污染，若无空白对照或阴性对照样本与待检测微生物样品同步实施整个实验与分析流程，则无法排除实验过程中的污染，很难判断待检测微生物样品的阳性结果是否与污染导致的假阳性相关。然而目前尚无针对临床需要的系统的全流程质控性mNGS检测病原微生物的解决方案。
技术实现思路
本专利技术提供全流程质控的病原微生物高通量测序检测方法，便于实现感染性疾病病原微生物的快速临床诊断，并以加入内参、设置阳性对照样本和空白对照样本，便于实现全流程质控。本专利技术提供全流程质控的病原微生物高通量测序检测方法，包括：在第一待检测微生物样品中加入内参，得到第二待检测微生物样品；分别提取所述第二待检测微生物样品、预先设定的阳性对照样本和空白对照样本中的DNA；采用病原微生物检测试剂盒分别对所述DNA样本构建测序文库；基于二代测序平台对所述测序文库进行测序，并对测序结果中的原始测序数据进行质控处理，并去除比对到宿主基因组的序列，获得待比对数据；基于预先建立的比对数据库，对所述待比对数据进行比对处理，根据比对结果，确定主要病原微生物。在一种可能实现的方式中，所述比对数据库为预先建立的微生物基因组数据库；且基于预先建立的微生物基因组数据库，对所述待比对数据进行比对处理，根据比对结果确定主要病原微生物的过程包括：将所述待比对数据与所述预先建立的微生物基因组数据库进行比对处理，计算比对到所述微生物基因组数据库中的病原微生物基因组的各项参数；根据计算得到的病原微生物的各项参数，确定所述主要病原微生物；其中，所述各项参数包括：所述待比对数据比对到病原微生物基因组的序列数、特异序列数、覆盖度和覆盖长度。在一种可能实现的方式中，在计算得到病原微生物的各项参数之后，还包括：根据所述第二待检测微生物样品的待比对数据比对到内参DNA的特异序列数，判断所述第二待检测微生物样品中的内参检测结果中相应的内参序列数是否为零，若是，判定检测失败。在一种可能实现的方式中，在计算得到病原微生物的各项参数之后，还包括：根据所述预先设定的阳性对照样本的待比对数据比对到所述预先建立的微生物基因组数据库的序列数，评价整个检测流程成功与否，若相应的微生物特异序列数为零，则判定为实验失败；根据所述预先设定的阳性对照样本的待比对数据比对到所述预先建立的微生物基因组数据库的序列数，和与所述阳性对照样本相关的参考序列数的比值结果，确定病原微生物的检出效率；在一种可能实现的方式中，在计算得到病原微生物的各项参数之后，还包括：根据所述预先设定的空白对照样本的待比对数据比对到所述预先建立的微生物基因组数据库的序列数，确定空白对照样本中的微生物检出结果，评价实验的污染情况。在一种可能实现的方式中，在确定空白对照样本中的微生物检出结果之后，还包括：比较所述预先设定的空白对照样本中的特定微生物的第一检出数量与所述第二待检测微生物样品中的特定微生物的第二检出数量；当所述第二检出数量与所述第一检出数量的数量比值大于预设比值时，判定所述第二待检测微生物样品中检测出的所述主要病原微生物为阳性结果。在一种可能实现的方式中，所述预先设定的阳性对照样本为已知微生物的混合物；所述预先设定的空白对照样本为无核酸酶水/缓冲液。在一种可能实现的方式中，在采用病原微生物检测试剂盒分别对所述DNA样本构建测序文库时，包括：对所述DNA样本进行末端修复、连接接头、DNA纯化、PCR富集和文库纯化。在一种可能实现的方式中，采用酶解法分别提取所述第二待检测微生物样品、预先设定的阳性对照样本和空白对照样本中的DNA。在一种可能实现的方式中，基于预先建立的比对数据库，对所述待比对数据进行比对处理，根据比对结果，确定主要病原微生物时，包括：步骤A1：利用公式(1)预先建立的比对数据库Si；其中，Si表示第i个病原微生物的数据信息，n表示病原微生物的总个数，m表示病原微生物的参数的总个数，fij表示病原微生物的第i个病原微生物的第j个参数的参数值，Di表示病原微生物的第i个病原微生物参数值总和；步骤A2：将公式(1)得到所述比对数据库与所述待比对数据通过公式(2)得到比对结果值Ki；其中，Ki表示所述待比对数据信息与第i个病原微生物的数据信息的比对结果值，K表示所述待比对数据的数据信息；步骤A3：利用公式(3)对公式(2)所求本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.全流程质控的病原微生物高通量测序检测方法，其特征在于，包括：/n在第一待检测微生物样品中加入内参，得到第二待检测微生物样品；/n分别提取所述第二待检测微生物样品、预先设定的阳性对照样本和空白对照样本中的DNA；/n采用病原微生物检测试剂盒分别对所述DNA样本构建测序文库；/n基于二代测序平台对所述测序文库进行测序，并对测序结果中的原始测序数据进行质控处理，并去除比对到宿主基因组的序列，获得待比对数据；/n基于预先建立的比对数据库，对所述待比对数据进行比对处理，根据比对结果，确定主要病原微生物。/n

【技术特征摘要】
1.全流程质控的病原微生物高通量测序检测方法，其特征在于，包括：
在第一待检测微生物样品中加入内参，得到第二待检测微生物样品；
分别提取所述第二待检测微生物样品、预先设定的阳性对照样本和空白对照样本中的DNA；
采用病原微生物检测试剂盒分别对所述DNA样本构建测序文库；
基于二代测序平台对所述测序文库进行测序，并对测序结果中的原始测序数据进行质控处理，并去除比对到宿主基因组的序列，获得待比对数据；
基于预先建立的比对数据库，对所述待比对数据进行比对处理，根据比对结果，确定主要病原微生物。


2.如权利要求1所述的全流程质控的病原微生物高通量测序检测方法，其特征在于，
所述比对数据库为预先建立的微生物基因组数据库；
且基于预先建立的微生物基因组数据库，对所述待比对数据进行比对处理，根据比对结果确定主要病原微生物的过程包括：
将所述待比对数据与所述预先建立的微生物基因组数据库进行比对处理，计算比对到所述微生物基因组数据库中的病原微生物基因组的各项参数；
根据计算得到的病原微生物的各项参数，确定所述主要病原微生物；
其中，所述各项参数包括：所述待比对数据比对到病原微生物基因组的序列数、特异序列数、覆盖度和覆盖长度。


3.如权利要求2所述的全流程质控的病原微生物高通量测序检测方法，其特征在于，在计算得到病原微生物的各项参数之后，还包括：
根据所述第二待检测微生物样品的待比对数据比对到内参DNA的特异序列数，判断所述第二待检测微生物样品中的内参检测结果中相应的内参序列数是否为零，若是，判定检测失败。


4.如权利要求2所述的全流程质控的病原微生物高通量测序检测方法，其特征在于，在计算得到病原微生物的各项参数之后，还包括：
根据所述预先设定的阳性对照样本的待比对数据比对到所述预先建立的微生物基因组数据库的序列数，评价整个检测流程成功与否，若相应的微生物特异序列数为零，则判定为实验失败；
根据所述预先设定的阳性对照样本的待比对数据比对到所述预先建立的微生物基因组数据库的序列数，和与所述阳性对照样本相关的参考序列数的比值结果，确定病原微生物的检出效率。


5.如权利要求2所述的全流程质控的病原微生物高通量测序检测方法，其特征在于，在计算得到病原微生物的各项参数之后，还包括：
根据所述预先设定的空白对照样本的待比对数据比对到所述预先建立的微生物基因组数据库的序列数，确定空白对照样本中的微生物检出结果，评价实验的污染情况。


6.如权利要求5所述的全流程质控的病原微生物高通量测序检测方法，其特征在于，在确定空白对照样本中的微生物检出结果之后，还包括：
比较所述预先设定的空白对照样本中的特定微生物的第一检出数量与所述第二待检测微生物样品中的特定...

【专利技术属性】
技术研发人员：夏涵，
申请(专利权)人：予果生物科技北京有限公司，西咸新区予果微码生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11