本发明专利技术提出一种用于BRAF基因V600E突变检测的引物对、试剂盒及其检测方法，属于生物医学临床分子检测领域，能够在BRAF V600E突变检测中消除野生型DNA，仅留下突变的BRAF V600E DNA，从而在PCR过程中突变信号放大，可有效减少假阴性结果、提高检测准确性。该引物对包括如SEQ No.1序列所示的上游引物和如SEQ No.2序列所示的下游引物。本发明专利技术能够应用于BRAF V600E(1799T>A)基因突变检测中突变信号的放大中。
【技术实现步骤摘要】
一种用于BRAF基因V600E突变检测的引物对、试剂盒及其检测方法
本专利技术属于生物医学临床分子检测领域，尤其涉及一种用于BRAF基因V600E突变检测的引物对、试剂盒及其检测方法。
技术介绍
BRAF为一种鸟苷酸结合蛋白RAS活化丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,在调节有丝分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路中发挥重要作用，是最重要的原癌基因之一。MAPK信号通路可正常调节细胞生长、分裂和分化,也可因RAF家族成员致癌性突变体的形成而引发癌症。其中BRAFV600突变体的产生显著增强了BRAF的活性,从而导致癌细胞分裂失控,大约8％的人类肿瘤发生BRAF突变。BRAF绝大部分突变形式为BRAFV600E突变，主要发生于转移性黑色素瘤、结肠癌、肺癌和甲状腺癌中。自2011年首个BRAFV600E靶向抑制剂批准上市后，有效延长了黑色素瘤患者无进展生存期及总生存期。液体活检血液检测技术曾被《麻省理工大学科技评论》评选为“2015年十大突破技术”，如今再次变得炙手可热，其通过血液或尿液等对癌症等疾病进行诊断，优势在于可通过非侵入性取样降低活检的危害，能有效延长患者生存期。目前液体活检的主要检测物包括检测血液中游离的循环肿瘤细胞，循环肿瘤DNA(ctDNA)碎片，循环RNA和外泌体等。凭借一管血检测癌症，这是数十年来全球医学界的共同的梦想。液体活检技术试图用各种技术手段从血液里捕捉相关肿瘤信息，从而规避了传统方式需要手术、穿刺取样的局限性。然而，利用循环游离肿瘤DNA来进行早期检测，ctDNA中的肿瘤DNA的含量非常少,肿瘤DNA的浓度常常低于检测极限，常规方法极易出现漏检，得到假阴性结果。因此，如何在BRAFV600E突变检测中仅留下突变的BRAFV600EDNA，使其在PCR过程中突变信号放大，从而减少假阴性结果、提高检测准确性对于本领域而言将是亟需解决的技术问题。
技术实现思路
本专利技术提出一种用于BRAF基因V600E突变检测的引物对、试剂盒及其检测方法，该方法能够在BRAFV600E突变检测中消除野生型DNA，仅留下突变的BRAFV600EDNA，从而在PCR过程中突变信号放大，可有效减少假阴性结果、提高检测准确性。为了达到上述目的，本专利技术提供了一种用于BRAF基因V600E突变检测的引物对，包括如SEQNo.1序列所示的上游引物和如SEQNo.2序列所示的下游引物。作为优选，包含如上述技术方案所示的引物对。作为优选，所述试剂盒包括含有所述引物对的第二试剂盒以及含有与所述引物对配合使用的探针的第一试剂盒，其中，所述探针包括如SEQNo.3序列所示的正义探针和如SEQNo.4序列所示的反义探针。作为优选，所述第一试剂盒还包括PCR反应管、去离子水、DSN缓冲液和未用DSN处理的阴性对照品。作为优选，所述第二试剂盒还包括PCR反应管、DSN处理后的DNA样品和未用DSN处理的阴性DNA对照品、PhusionHF缓冲液、去离子水、dNTP和聚合酶。本专利技术还提供了一种利用上述任一项技术方案所述的试剂盒进行BRAF基因V600E突变检测的方法，包括以下步骤：将模板DNA、正义探针和反义探针加入第一试剂盒中的PCR管中进行PCR反应，具体包括在98℃下反应2min，待模板DNA变性后，将温度降至67℃，同时加入1个单位的DSN的缓冲液，混匀后在67℃反应20min后，将温度升高至95℃继续反应20min使DSN失活，得到DSN缓冲液处理后的DNA样品；同时，建立不加入1个单位的DSN缓冲液的阴性DNA对照品；将DSN缓冲液处理后的DNA样品或阴性DNA对照品、引物对、PhusionHF缓冲液、去离子水、dNTP和聚合酶加入第二试剂盒中的PCR管中进行聚合酶链反应，分别得到聚合酶链产物。作为优选，利用所述第一试剂盒进行PCR反应时，各反应物具体加入以下体积，共计10μl：作为优选，利用所述第二试剂盒进行聚合酶链反应时，各反应物具体加入以下体积，共计25μl：聚合酶链反应的条件为：98℃反应2min,随后以98℃10sec,58℃20sec和72℃10sec循环45次，最后在72℃反应5min。作为优选，还包括利用PCR纯化试剂盒对所得到的聚合酶链产物分别进行纯化，然后利用桑格序列对其进行分别测序的步骤。本专利技术还提供了一种如上述技术方案所述的引物对和所述的试剂盒在BRAF基因V600E突变检测中对突变信号进行放大中的应用。与现有技术相比，本专利技术的优点和积极效果在于：本专利技术所提供的BRAF基因V600E突变检测试剂盒中通过设计了有针对性的引物对以及与该引物对相匹配的探针，使得样品在经过DSN处理后,可有效消除野生型的DNA，仅保留突变的BRAFV600EDNA，使其在PCR反应中能够将突变信号进行放大，这样可大大减少假阴性结果,增加检测的准确性，从而对甲状腺癌、结直肠癌、肺癌以及转移性黑色素瘤患者中具有BRAFV600E突变的患者进行用药指导。附图说明图1为本专利技术实施例所提供的DSN缓冲液处理后的DNA样品和阴性DNA对照品在突变频率为5％时的试验结果；图2为本专利技术实施例所提供的DSN缓冲液处理后的DNA样品和阴性DNA对照品在突变频率为1％时的试验结果；图3为本专利技术实施例所提供的DSN缓冲液处理后的DNA样品和阴性DNA对照品在突变频率为0.1％时的试验结果。具体实施方式下面将对本专利技术实施例所提供的用于BRAF基因V600E突变检测的引物对、试剂盒及其检测方法的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例1材料说明：模板DNA:由于BRAFV600EDNA从人体中极难获得，因此本专利技术实施例中所使用的模板DNA为CatalogID:HD238,BRAFV600EReferenceStandard。1、引物对：上游引物：BRAFV600EPCRF:ACCATCCACAAAATGGATCCAG(SEQNo.1)下游引物：BRAFV600EPCRR:ATTTCTTCATGAAGACCTCACAG(SEQNo.2)2、探针：正义探针：BRAFV600Eantisense_2probe:CCCACTCCATCGAGATTTCACTGTA(SEQNo.3)反义探针：BRAFV600Esense_2probe:TTTGGTCTAGCTACAGTGAAATCTCG(SEQNo.4)3、试剂盒：第一试剂盒：正义探针、反义探针、PCR反应管、去离子水、DSN缓冲液和未用DSN处理的阴性对照品；第二试剂盒：上游引物、下游引物、PCR反应管、DSN处理后的DNA样品和未用DSN处理的阴性DNA对照品、PhusionHF缓冲液、去离子水、dNTP和聚合酶。检测方法：取第一试剂盒，对模板DNA进行处理，体系如下：具体的，将模板DNA、正义探针和反义探针加入到PCR管中进行PCR反应，具体为在98℃下反应2min让模板DNA变性，将温度降至67℃，此时PCR管仍放置在PCR仪中不取出，加入1个单位的DSN(DSNEvrogen,EA001)的缓冲液，混匀后在67℃反应20min后本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于BRAF基因V600E突变检测的引物对，其特征在于，包括如SEQ No.1序列所示的上游引物和如SEQ No.2序列所示的下游引物。
【技术特征摘要】
1.一种用于BRAF基因V600E突变检测的引物对，其特征在于，包括如SEQNo.1序列所示的上游引物和如SEQNo.2序列所示的下游引物。2.一种用于BRAF基因V600E突变检测的试剂盒，其特征在于，包含如权利要求1所示的引物对。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括含有所述引物对的第二试剂盒以及含有与所述引物对配合使用的探针的第一试剂盒，其中，所述探针包括如SEQNo.3序列所示的正义探针和如SEQNo.4序列所示的反义探针。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述第一试剂盒还包括PCR反应管、去离子水、DSN缓冲液和未用DSN处理的阴性对照品。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述第二试剂盒还包括PCR反应管、DSN处理后的DNA样品和未用DSN处理的阴性DNA对照品、PhusionHF缓冲液、去离子水、dNTP和聚合酶。6.一种利用权利要求2-5任一项所述的试剂盒进行BRAF基因V600E突变检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：将模板DNA、正义探针和反义探针加入第一试剂盒中的PCR管中进行PCR反应，具体包括在98℃下反应2min，待模板DNA变性后，将温度降至67℃，同...
【专利技术属性】
技术研发人员：姚斐，宫小明，
申请(专利权)人：青岛普泽麦迪生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37
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