一种单细胞全基因组测序的方法技术

本发明专利技术提供了一种单细胞全基因组测序的方法，及一种扩增方法在构建基因文库、单分子测序中的用途，所述的扩增方法包括将核酸与核酸聚合酶、随机引物接触进行核酸与链的多重置换扩增。

A single cell whole genome sequencing method

【技术实现步骤摘要】
一种单细胞全基因组测序的方法
本专利技术涉及分子生物学领域，具体涉及一种单细胞全基因组测序的方法及一种扩增方法在单分子测序中的用途。
技术介绍
单细胞全基因组测序技术是在单细胞水平对全基因组进行扩增与测序的一项新技术。其原理是将分离的单个细胞的微量全基因组DNA进行扩增，获得高覆盖率的完整的基因组之后通过外显子捕获进而高通量测序用于揭示细胞群体差异和细胞进化关系。单细胞全基因组扩增是指在单细胞水平对全基因组进行扩增的新技术,其原理是将分离的单个细胞的微量全基因组DNA进行扩增,获得高覆盖率的完整的基因组后进行高通量测序,用于揭示细胞异质性。目前，WGA方法主要包括引物延伸预扩增(primerextensionpre-amplificationPCR，PEP-PCR)、简并寡核苷酸引物PCR(degenerateoligo-nucleotideprimedPCR，DOP-PCR)、多重置换扩增(multipledisplacementamplification，MDA)、多次退火环状循环扩增(multipleannealingandlooping-basedamplificationcycles，MALBAC)等专利CN101213311A公开了利用滚环扩增法扩增和克隆单个DNA分子，被扩增的DNA足够无本底，无需进一步纯化而能将其直接用于测序。专利CN104630202A公开了一种能够减小微量核酸物质整体扩增时产生偏倚的扩增方法，包括将所述核酸物质随机分散到若干互不连通的独立反应体系中，扩增使用的引物序列中包含3-20个随机碱基，随机碱基随机选自A、G、C、T中的二个、三个或四个。使用该方法相对于微量核酸物质在大体系中的扩增方法，扩增偏倚降低降低1个数量级以上，扩增结果能够准确反应原始核酸物质中的定量信息，可允许更多的扩增循环，从而获得更多的产物。专利CN104560950A公开了一种基于MDA的全基因组扩增的方法，及扩增试剂盒，并将获得的纯化的DNA用于二代测序。目前尚未存在单分子测序单细胞全基因组测序中的应用。
技术实现思路
本专利技术提供了一种单细胞全基因组测序的方法，所述的方法包括如下步骤：获取单细胞，提取单细胞中的核酸；扩增所述提取的单细胞中的核酸得到1-100kb的长核酸序列；对所述的长核酸序列进行单分子测序。优选的，所述单细胞的获取方法选自有限稀释法、显微操作法、荧光流式分选法、微液滴技术、激光显微切割技术或直接采用毛细管挑取单个细胞。在本专利技术的一个具体实施方式中，所述的获取单细胞的方法为微液滴技术。在本专利技术的另一个具体实施方式中，所述的获取单细胞的方法为直接采用毛细管挑取单个细胞。优选的，所述扩增的方法包括将核酸与核酸聚合酶、随机引物接触进行核酸与链的多重置换扩增。更优选的，所述扩增的方法包括恒温条件下，将核酸与核酸聚合酶、随机引物接触进行核酸与链的多重置换扩增。在本专利技术的一个具体实施方式中，所述扩增的方法包括将单细胞中的基因组DNA囊封在微滴中，然后进行恒温条件下，将囊封在微滴中的核酸与核酸聚合酶、随机引物接触进行核酸与链的多重置换扩增。在本专利技术的另一个具体实施方式中，所述扩增的方法包括将六聚体随机引物(N6)结合到基因组DNA上，DNA聚合酶结合到六聚体随机引物3’末端进行链置换扩增反应，被置换下来的单链继续结合引物，进行下一级的链置换扩增反应；获得带有多分枝状结构的长核酸产物；利用S1核酸酶消化所述多分枝状扩增产物，得到长度为1-100kb的线性双链平末端核酸产物，所述的线性双链平末端核酸产物为长核酸序列。本专利技术所述的单细胞可以是原核细胞或真核细胞。所述的原核细胞可以为细菌、放线菌、蓝藻、支原体或立克次氏体，所述真核细胞可以是植物细胞或动物细胞及微生物细胞。所述动物细胞具体选自组织消化的细胞、培养所得的细胞、胚胎发育早期的细胞、癌症细胞、未经富集培养的微生物细胞、流式分选获得的细胞、有限稀释获得的细胞、激光捕获等方法获得的细胞中的任一种。其中，所述的癌症细胞为癌症早期的细胞。本专利技术所述的随机引物为六聚体随机引物(N6)，序列为5-NpNpNpNpsNpsN-3。优选的，所述核酸聚合酶为DNA聚合酶，所述的DNA聚合酶选自Phi29DNA聚合酶、TtsDNA聚合酶、M2DNA聚合酶、VENTDNA聚合酶、T5DNA聚合酶、PRD1DNA聚合酶、BstDNA聚合酶或REPLI-gscDNA聚合酶。优选的，所述的DNA聚合酶为Phi29DNA聚合酶。所述Phi29DNA聚合酶具有3-5外切酶活性，错误率仅为5x10-6，保证扩增的高保真性。优选的，所述长核酸序列长度为1-100kb。优选的，所述长核酸序列选自单链DNA、双链DNA、单链RNA、双链RNA、双链RNA/DNA杂交体、部分杂交的DNA以及RNA，或者，经过酶学、化学、生物学方法处理过的DNA或RNA。本专利技术所述的经过酶学、化学、生物学方法处理过的DNA或RNA选自经过免疫沉淀后提取的DNA、亚硫酸盐处理后的DNA、经过甲基转移酶处理后的DNA、RNA经过逆转录处理后的cDNA等。优选的，所述单分子测序选自基于光信号的单分子测序或基于电信号的单分子测序。更优选的，所述的基于光信号的单分子测序为单分子荧光实时测序系统(SingleMoleculeRealTime，SMRT)测序。基于光信号的单分子测序，原理为脱氧核苷酸用荧光标记，显微镜可以实时记录荧光的强度变化。当荧光标记的脱氧核苷酸被掺入DNA链的时候，它的荧光就同时能在DNA链上探测到。当它与DNA链形成化学键的时候，它的荧光基团就被DNA聚合酶切除，荧光消失。这种荧光标记的脱氧核苷酸不会影响DNA聚合酶的活性，并且在荧光被切除之后，合成的DNA链和天然的DNA链完全一样，是一种边合成边测序的方法。更优选的，所述的基于电信号的单分子测序可以为纳米孔测序(nanoporesequencing)。基于电信号的单分子测序，原理为采用电泳技术，借助电泳驱动单个分子逐一通过纳米孔来实现测序的。由于纳米孔的直径非常细小，仅允许单个核酸聚合物通过，而A、T、C或G单个碱基的大小不同，形成的阻遏电流不同，通过电信号的差异就能检测出通过的碱基类别，从而实现测序。优选的，所述单分子测序包括构建长片段测序文库，将构建的长片段测序文库进行纳米孔测序或SMRT，获得序列的特征。本专利技术所述的序列的特征选自DNA的来源、长度、同一性、序列、二级结构或DNA是否被修饰。在本专利技术的一个具体实施方式中，所述的构建文库的方法包括对所述的长核酸序列进行末端修复、通过3端加A与接头进行链接反应完成文库制备。在本专利技术的一个具体实施方式中，所述的构建文库的方法包括提供转座酶和转座子组合物，将组合物与扩增获得的产物接触并反应，为扩增长核酸序列加上测序所需接头。优选的，所述纳米孔测序步骤包括将构建的长片段测序文库中的DNA与孔、本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种单细胞全基因组测序的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：/n获取单细胞，提取单细胞中的核酸；/n扩增所述提取的单细胞中的核酸得到1-100kb的长核酸序列；/n对所述长核酸序列进行单分子测序；/n其中，所述扩增的方法包括将核酸与核酸聚合酶、随机引物接触进行核酸与链的多重置换扩增。/n

【技术特征摘要】
1.一种单细胞全基因组测序的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：
获取单细胞，提取单细胞中的核酸；
扩增所述提取的单细胞中的核酸得到1-100kb的长核酸序列；
对所述长核酸序列进行单分子测序；
其中，所述扩增的方法包括将核酸与核酸聚合酶、随机引物接触进行核酸与链的多重置换扩增。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述扩增的方法包括恒温条件下，将核酸与核酸聚合酶、随机引物接触进行核酸与链的多重置换扩增。


3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述长核酸序列选自单链DNA、双链DNA、单链RNA、双链RNA、双链RNA/DNA杂交体、部分杂交的DNA以及RNA，或者，经过酶学、化学、生物学方法处理过的DNA或RNA。


4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，所述单分子测序选自基于光信号的单分子测序或基于电信号的单分子测序；优选的，所述单分子测序为纳米孔测序、单分子荧光实时测序系统。


5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，所述的单细胞获取的方法选自有限稀释法、显微操作法、荧光流式分选法、微液滴技术、激光显微切割技术或直接采用毛细管挑取单个细胞。


6.根据权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于，所述的单分子测序包括构建长片段测序文库，将构建的长片段测序文库进行纳米孔测序或单分子荧光实时测序。


7.根据权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于，所述的方法包括：
获取单细胞，提取单细胞中的核酸；所述的获取单细胞的方法选自有限稀释法、显微操作法、荧光流式分选法、微液滴技术、激光显微切割技术或直接采用毛细管挑取单个细胞，所述的提取单细胞中的核酸包括对单细胞进行细胞裂解，提取基因组DNA；
扩增所述单细胞中的核酸得到1-100kb的长核酸序列；所述的扩增包括将六聚体随机引物(N6)结合到基因组DNA上，聚合酶结合到六聚体随机引物3’末端进行链置换扩增反应，被置换下来的单链继续结合引物，进行下一级的链置换扩增反应；获得带有多分枝状结构的长核酸产物；利用S1核酸酶消化所述多分枝状扩增产物，得到长度为1-100kb的线性双链平末端核酸产物，所述的线性双链平末端核酸产物为长核酸序列；
对所述长核酸序列进行单分子测序；所述的单分子测序包括将获得的1-100kb的长核酸序列进行构建长片段测序文库；将所述的长片段测序文库中的双链DNA在解旋酶的作用下解链为单链DNA，解旋的同时单链DNA在电压的驱动下通过嵌在膜上的纳米孔；单链DNA上四种不同的碱基通过纳米孔时会形成不同的阻遏电流，通过记录阻遏电流的大小，确定DNA的碱基序列。


8.根据权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于，所述的方法包括：
获取单细胞，提取单细胞中的核酸；所述的获取单细胞的方法选自有限稀释法、显微操作法、荧光流式分选法、微液滴技术、激光显微切割技术或直接采用毛细管挑取单个细胞，所述的提取单细胞中的核酸包括将单细胞进行细胞裂解，提取基因组DNA；
扩增所述单细胞中的核酸得到1-100kb的长核酸序列；所述的扩增包括将六聚体随机引物(N6)结合到基因组DNA上，DNA聚合酶结合到六聚体随机引物3’末端进行链置...

【专利技术属性】
技术研发人员：白净卫，刘册，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：北京;11