麦芽糖依赖性降解决定子、麦芽糖响应型启动子、稳定化构建体及其在生成非分解代谢化合物中的用途制造技术

本发明专利技术涉及麦芽糖依赖性降解决定子用于在翻译后水平上控制与其融合的目的蛋白的稳定性的用途。本发明专利技术还涉及麦芽糖依赖性降解决定子与麦芽糖响应型启动子组合用于在转录水平上控制基因表达和在翻译后水平上控制蛋白稳定性的用途。本发明专利技术还涉及使影响细胞生长的蛋白的表达与非分解代谢化合物的生成进行偶联的稳定化构建体的用途。本发明专利技术还涉及合成麦芽糖响应型启动子的用途。本发明专利技术进一步提供了单独或以各种组合使用麦芽糖依赖性降解决定子、麦芽糖响应型启动子和稳定化构建体在遗传修饰的宿主细胞中生成非分解代谢化合物的组合物和方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】麦芽糖依赖性降解决定子、麦芽糖响应型启动子、稳定化构建体及其在生成非分解代谢化合物中的用途1.相关申请的交叉引用本申请要求并享有于2015年6月25日提交的美国临时专利申请号62/184,793和2015年12月11日提交的美国临时专利申请号62/266,436的优先权，所述这两个申请通过引用并入本文。2.专利
本专利技术总体涉及麦芽糖依赖性降解决定子、麦芽糖响应型启动子和稳定化构建体。本专利技术还涉及其在通过遗传修饰的宿主细胞来控制基因表达、蛋白稳定性和非分解代谢化合物生成中的用途。3.专利技术背景合成生物学的出现带来了可在工业规模和质量上利用可再生资源发酵生成生物燃料、化学品和生物材料的希望。譬如，已在微生物宿主中成功构建了功能性非天然生物学途径，用于生成抗疟药青蒿素的前体类(参见例如Martinetal.,NatBiotechnol21：796-802(2003))；脂肪酸衍生的燃料类和化学品类(例如，脂肪酯类、脂肪醇类和蜡类；参见例如Steenetal.,Nature463：559-562(2010))；制备降胆固醇药物的聚酮合酶类(参见例如Maetal.,Science326：589-592(2009))；和聚酮类化合物(参见例如Kodumal，ProcNatlAcadSciUSA101：15573-15578(2004))。然而，合成生物学的商业成功在很大程度上将取决于可再生成品的生成成本是否可竞争或优于与其相应的不可再生成品的生成成本。菌株稳定性可能是工业发酵成本的主要驱动因素，因为它影响连续发酵可有效运行的时长。菌株稳定性通常是指微生物在延长培养时间中仍维持非分解代谢发酵产物的有利生成特征(例如，高产率(每克底物得到化合物的克数)和生产率(每升发酵液每小时得到的克数)。尤其是遗传稳定性，是指生成微生物群倾向于随着时间的推移几乎不改变与产品生成相关的基因的预期等位基因频率，所述遗传稳定性在产品的持续生成中起主要作用。对于生物量以外的产品(根据定义，这些产品消耗代谢能量和碳源，以免所述碳源用于生成更多的细胞)的非分解代谢发酵，不稳定性的基础有两重：进化突变和选择性。首先，生成损失突变是自发和随机地生成的。其次，产物产率下降的细胞的生长率或“适应性”优势导致低生成者对最终的细胞群产生影响，从而降低整体培养性能。此种现象可被称为“菌株退化”。巴西燃料乙醇在长时间发酵过程中，从糖获得非常高的乙醇产率，即最大理论产率的约90％。这在某种程度上是因为通过分解代谢生成的乙醇：每分子糖生成2分子ATP(三磷酸腺苷)，并且在没有氧气的情况下达到氧化还原平衡。突变不生成乙醇的细胞在发酵罐的低氧条件下不太适合，并且不会对细胞群产生影响。这使得工业乙醇发酵在整个周期重复利用大部分酵母生物量，从而使糖转化成酵母细胞生物量的转化率最低并将几乎所有的糖导向乙醇生成。生物量的这种扩展繁殖和再利用提高了乙醇生成的效率：运营支出减少，因为在每个周期中糖转化为生物量减少(即产率增加)；和资本支出减少，因为需要更少和更小的发酵罐来构建用于接种的生物量。相比之下，乙酰辅酶A(acetyl-CoA)衍生的烃类(例如，类异戊二烯、脂肪酸和聚酮化合物)的生成通常本质上是非分解代谢的；它们通常需要净输入ATP(三磷酸腺苷)、NADPH(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)和碳源，通常需要大量氧气来帮助平衡氧化还原系统。此环境使产品向更低级的产物演变，越高的生物量产生的基因型越有利，并导致更高的菌株退化率。降低生成非分解代谢产物的负面选择压力的一种方式是在生成不需要的产物的过程期间，例如在必须生成生物量以使发酵罐的生产率最大化的发酵阶段期间阻断其形成。因此，本领域需要能够控制发酵过程中非分解代谢化合物生成的时机的开关。本领域还需要在发酵过程中降低菌株退化速率和使生成非分解代谢化合物稳定的方法和组合物。本专利技术提供的组合物和方法满足所述这些需求，并且它们可用于发酵环境之外的其他应用。4.专利技术摘要本专利技术提供了利用麦芽糖依赖性降解决定子(maltosedependentdegron)来控制与所述麦芽糖依赖性降解决定子融合的任何蛋白的稳定性的组合物和方法。在其中一个实施方案，所述麦芽糖依赖性降解决定子是通过修饰已知与麦芽糖结合的蛋白(例如，MBP或麦芽糖结合蛋白)而得到，当其不与麦芽糖结合时变得不稳定。因此，本专利技术提供的麦芽糖依赖性降解决定子依赖于其与其配体(例如麦芽糖)结合而稳定。在一些实施方案，所述麦芽糖依赖性降解决定子可与麦芽糖响应型启动子组合使用，以同时控制蛋白的表达和稳定性的时机。譬如，用于生成非分解代谢化合物的生物合成途径的酶的表达可通过操作培养基中麦芽糖含量，使用所述麦芽糖依赖性降解决定子和麦芽糖响应型启动子直接或间接控制。因此，在一些实施方案，可利用相同的分子效应因子(例如，麦芽糖)来提供基因表达的转录和翻译后控制。本专利技术还提供了利用稳定化构建体的组合物和方法，所述稳定化构建体对生成高产物产率的原始菌株提供生长有利条件，和对已变成低生成者或非生成者的自发突变细胞提供生长不利条件。结果，所述生成高产物产率的原始菌株过度生长而超出了突变的细胞，并且在发酵期间稳定了所需产物(例如，非分解代谢化合物)的生成。在本专利技术提供的组合物和方法中，麦芽糖依赖性降解决定子、麦芽糖响应型启动子和稳定化构建体可以单独使用、组合使用或以次组合使用。一方面，本专利技术提供了利用麦芽糖依赖性降解决定子作为开关来调控任何目的蛋白的稳定性的组合物和方法。在具体实施方案中，麦芽糖依赖性降解决定子与目的蛋白融合，所述目的蛋白对在遗传修饰的宿主细胞中生成所需产物(如非分解代谢化合物)具有影响。在一些实施方案，在麦芽糖结合蛋白(MBP)中引入一个或多个突变以将其转化成麦芽糖依赖性降解决定子(也称为麦芽糖结合降解决定子)，当其与麦芽糖结合时，相较其不与麦芽糖结合时更稳定。在麦芽糖不存在情况下，麦芽糖依赖性降解决定子和与其融合的任何蛋白均是不稳定的或无活性的，导致所述融合蛋白更快降解。因此，通过操作所述麦芽糖含量可控制与麦芽糖依赖性降解决定子融合的任何目的蛋白的稳定性。在一些实施方案，宿主细胞中的所述融合蛋白的稳定性可对靶分子，例如在发酵过程中生成非分解代谢化合物的生物合成途径的酶，具有下游效应。譬如，如果融合蛋白包含与麦芽糖依赖性降解决定子框内融合的转录调控因子，则其稳定性可通过从培养基中添加或除去麦芽糖来控制。在此类实施方案中，所述培养基中的所述麦芽糖依赖性降解决定子和麦芽糖含量可用作开关来控制非分解代谢化合物的生成。同时麦芽糖依赖性降解决定子在发酵过程中是有用的，它们可用于需调节目的蛋白的稳定性和/或靶分子生成的任何环境中。因此，一方面，本专利技术提供了调节蛋白稳定性的方法，其中所述方法包括使麦芽糖与融合蛋白接触，所述融合蛋白包含与麦芽糖依赖性降解决定子框内融合的目的蛋白。在一些实施方案，当所述麦芽糖依赖性降解决定子与麦芽糖接触时，与所述麦芽糖依赖性降解决定子不与麦芽糖接触时相比，所述融合蛋白更稳定。在一些实施方案，所述方法进一步包括从与所述融合蛋白的接触除去麦芽糖。在一些实施方案，从与所述融合蛋白的接触除去麦芽糖之后的所述融合蛋白的半衰期比包含与所述目的蛋白框内融合的野生型麦芽糖结本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.调节蛋白稳定性的方法，所述方法包括使麦芽糖基诱导物与融合蛋白接触，所述融合蛋白包含与麦芽糖依赖性降解决定子框内融合的目的蛋白，其中当所述麦芽糖依赖性降解决定子与所述麦芽糖基诱导物接触时，与所述麦芽糖依赖性降解决定子不与所述麦芽糖基诱导物接触时相比，所述融合蛋白更稳定。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.06.25 US 62/184793;2015.12.11 US 62/2664361.调节蛋白稳定性的方法，所述方法包括使麦芽糖基诱导物与融合蛋白接触，所述融合蛋白包含与麦芽糖依赖性降解决定子框内融合的目的蛋白，其中当所述麦芽糖依赖性降解决定子与所述麦芽糖基诱导物接触时，与所述麦芽糖依赖性降解决定子不与所述麦芽糖基诱导物接触时相比，所述融合蛋白更稳定。2.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括从与所述融合蛋白的接触除去所述麦芽糖基诱导物。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中从与所述融合蛋白的接触除去所述麦芽糖基诱导物之后的所述融合蛋白的半衰期比包含与所述目的蛋白框内融合的野生型MBP的融合蛋白的半衰期小至少约50％。4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，所述方法进一步包括提供宿主细胞，所述宿主细胞包含编码所述融合蛋白的异源性核酸，其中所述使所述融合蛋白与所述麦芽糖基诱导物接触包括在包含所述麦芽糖基诱导物的培养基中培养表达所述融合蛋白的所述宿主细胞。5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其中所述融合蛋白直接或间接调节一种或多种靶分子的水平。6.根据权利要求4或5所述的方法，其中所述宿主细胞进一步包含生物分子，所述生物分子在所述宿主细胞中与所述融合蛋白相互作用以调节所述一种或多种靶分子的水平。7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其中所述目的蛋白是转录调控因子。8.根据权利要求7所述的方法，其中所述目的蛋白包含Gal80p。9.根据权利要求6-8任一项所述的方法，其中所述生物分子是转录激活因子。10.根据权利要求5-9任一项所述的方法，其中所述一种或多种靶分子是生成非分解代谢化合物的生物合成途径中的酶。11.根据权利要求5-9任一项所述的方法，其中所述一种或多种靶分子包含非分解代谢化合物。12.根据权利要求4-11任一项所述的方法，其中编码所述融合蛋白的所述异源性核酸序列被整合到所述宿主细胞的基因组中。13.根据权利要求4-12任一项所述的方法，其中编码所述融合蛋白的所述异源性核酸可操作地连接至编码所述目的蛋白的基因的内源性启动子。14.根据权利要求4-12任一项所述的方法，其中编码所述融合蛋白的所述异源性核酸可操作地连接至麦芽糖响应型启动子。15.根据权利要求1-14任一项所述的方法，其中所述融合蛋白中的所述麦芽糖依赖性降解决定子包含与SEQIDNO：2或SEQIDNO：28具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、或95％序列同一性的氨基酸序列，和与SEQIDNO：2或SEQIDNO：28相比，包含一个或多个变体氨基酸残基。16.根据权利要求1-14任一项所述的方法，其中所述融合蛋白中的所述麦芽糖依赖性降解决定子包含与SEQIDNO：2或SEQIDNO：28具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、或95％序列同一性的氨基酸序列，和包含位于选自7、10、11、21、24、28、42、43、64、68、83、88、92、95、98、101、110、117、134、135、136、149、168、177、186、187、193、198、210、216、217、229、236、237、242、263、291、304、321、322、339、351、357、367、370和374的一个或多个位置的一个或多个变体氨基酸残基，其中所述这些变体氨基酸残基的所述位置对应于SEQIDNO：2或SEQIDNO：28的氨基酸位置。17.根据权利要求1-14任一项所述的方法，其中所述融合蛋白中的所述麦芽糖依赖性降解决定子包含与SEQIDNO：2或SEQIDNO：28具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、或95％序列同一性的氨基酸序列，和包含选自由K7R、I10T、W11G、L21S、V24A、F28Y、D42V、K43E、A64T、F68S、D83G、D88N、P92T、W95R、V98I、N101I、A110T、I117V、P134S、A135T、L136M、M149I、Y168C、Y168N、Y177H、N186S、A187P、L193S、D198V、D210E、A216V、A217D、G229C、I236N、D237N、N242D、L263M、L291V、A304S、T321N、M322L、A339T、A351T、T357S、T367S、S370P和N374S组成的组的一个或多个变体氨基酸残基，其中所述一个或多个变体氨基酸残基的位置对应于SEQIDNO：2或SEQIDNO：28的氨基酸位置。18.根据权利要求15-17任一项所述的方法，其中与SEQIDNO：2相比，所述麦芽糖依赖性降解决定子在位置365之后被截短。19.根据权利要求17或18所述的方法，其中所述一个或多个变体氨基酸残基包含I10T、V24A、D42V、M149I和A216V，其中所述一个或多个变体氨基酸残基的位置对应于SEQIDNO：2的氨基酸位置。20.根据权利要求17-19任一项所述的方法，其中与SEQIDNO：2或SEQIDNO：28相比，所述麦芽糖依赖性降解决定子包含至少一组变体氨基酸残基，其中所述至少一组变体氨基酸残基是选自由以下变体氨基酸残基组组成的组：(a)I10T、V24A、D42V、K43E、D83G、P92T、M149I、Y168N、N186S、A216V、和T357S；(b)I10T、V24A、D42V、K43E、D83G、M149I、Y168N、N186S、A216V、和D237N；(c)I10T、V24A、D42V、K43E、D83G、M149I、Y168N、N186S、A216V、和A339T；(d)I10T、V24A、D42V、K43E、D83G、M149I、Y168N、N186S、A216V、和N242D；(e)I10T、V24A、D42V、A110T、M149I、和A216V；(f)I10T、V24A、D42V、K43E、D83G、M149I、Y168N、N186S、和A216V；(g)L21S、A64T、L136M、Y177H、A187P、A304S、T321N、和A351T；(h)K7R、D83G、V98I、L193S、I236N、和N374S；(i)W11G、D88N、P134S、A135T、D210E、和M322L；(j)I117V、Y168N、G229C、L263M、T367S、和S370P；(k)F68S、W95R、N186S、和D198V；和(l)F28Y、K43E、N101I、Y168C、A217D、和L291V。21.根据权利要求20所述的方法，其中所述麦芽糖依赖性降解决定子包含选自由以下组成的组的序列：(a)SEQIDNOS：4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、和26；(b)SEQIDNOS：16、18、20、22、24、和26的位置1至位置365；和(c)SEQIDNOS：16、18、20、22、24、和26的位置1至位置370。22.控制遗传修饰的宿主细胞中目的蛋白的表达和稳定性的方法，所述方法包括：(a)在包含碳源的培养基中培养遗传修饰的宿主细胞群，所述碳源包含麦芽糖基诱导物，其中所述遗传修饰的宿主细胞包含与编码融合蛋白的异源性核酸可操作地连接的麦芽糖响应型启动子，所述融合蛋白包含与麦芽糖依赖性降解决定子框内融合的目的蛋白；和(b)在包含碳源的培养基中培养所述宿主细胞群或其亚群，其中与步骤(a)中的所述培养基相比，所述麦芽糖基诱导物不存在或以足够低的量存在。23.根据权利要求22所述的方法，其中与步骤(b)相比，在步骤(a)中在所述麦芽糖基诱导物存在下，所述异源性核酸的转录被激活，和由其编码的所述融合蛋白被稳定。24.根据权利要求22或23所述的方法，其中编码所述融合蛋白的所述异源性核酸被整合到所述遗传修饰的宿主细胞的基因组中。25.根据权利要求24所述的方法，其中整合到所述遗传修饰的宿主细胞的所述基因组中的所述异源性核酸功能性破坏编码所述目的蛋白的内源性核酸。26.根据权利要求22-25任一项所述的方法，其中所述融合蛋白直接或间接调节一种或多种靶分子的水平。27.根据权利要求26所述的方法，其中所述遗传修饰的宿主细胞进一步包含生物分子，所述生物分子在所述宿主细胞中与所述融合蛋白相互作用以调节所述一种或多种靶分子的水平。28.根据权利要求25或26所述的方法，其中所述遗传修饰的宿主细胞进一步包含编码所述一种或多种靶分子的一种或多种异源性核酸。29.根据权利要求22-28任一项所述的方法，其中所述目的蛋白是转录调控因子。30.根据权利要求29所述的方法，其中所述目的蛋白是Gal80p。31.根据权利要求27-30任一项所述的方法，其中所述生物分子是转录激活因子。32.根据权利要求29所述的方法，其中所述生物分子是Gal4p，和编码所述一种或多种靶分子的所述一种或多种异源性核酸中的每一种可操作地连接至Gal4p响应型启动子。33.根据权利要求26-32任一项所述的方法，其中所述一种或多种靶分子是生物合成途径的酶，其中所述酶是由所述融合蛋白的活性进行负调控，和其中所述融合蛋白在所述麦芽糖基诱导物存在下是稳定的。34.根据权利要求33所述的方法，其中所述一种或多种靶分子进一步包括由所述生物合成途径中的所述酶生成的非分解代谢化合物。35.根据权利要求22-34任一项所述的方法，其中所述融合蛋白中的所述麦芽糖依赖性降解决定子包含与SEQIDNO：2或SEQIDNO：28具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、或95％序列同一性的氨基酸序列，和与SEQIDNO：2或SEQIDNO：28相比，包含一个或多个变体氨基酸残基。36.根据权利要求22-34任一项所述的方法，其中所述融合蛋白中的所述麦芽糖依赖性降解决定子包含与SEQIDNO：2或SEQIDNO：28具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、或95％序列同一性的氨基酸序列，和包含位于选自7、10、11、21、24、28、42、43、64、68、83、88、92、95、98、101、110、117、134、135、136、149、168、177、186、187、193、198、210、216、217、229、236、237、242、263、291、304、321、322、339、351、357、367、370和374的一个或多个位置的一个或多个变体氨基酸残基，其中所述这些变体氨基酸残基的所述位置对应于SEQIDNO：2或SEQIDNO：28的氨基酸位置。37.根据权利要求22-34任一项所述的方法，其中所述融合蛋白中的所述麦芽糖依赖性降解决定子包含与SEQIDNO：2或SEQIDNO：28具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、或95％序列同一性的氨基酸序列，和包含选自由K7R、I10T、W11G、L21S、V24A、F28Y、D42V、K43E、A64T、F68S、D83G、D88N、P92T、W95R、V98I、N101I、A110T、I117V、P134S、A135T、L136M、M149I、Y168C、Y168N、Y177H、N186S、A187P、L193S、D198V、D210E、A216V、A217D、G229C、I236N、D237N、N242D、L263M、L291V、A304S、T321N、M322L、A339T、A351T、T357S、T367S、S370P和N374S组成的组的一个或多个变体氨基酸残基，其中所述一个或多个变体氨基酸残基的位置对应于SEQIDNO：2或SEQIDNO：28的氨基酸位置。38.根据权利要求35-37任一项所述的方法，其中与SEQIDNO：2相比，所述麦芽糖依赖性降解决定子在位置365之后被截短。39.根据权利要求35或38所述的方法，其中所述一个或多个变体氨基酸残基包含I10T、V24A、D42V、M149I和A216V，和其中所述一个或多个变体氨基酸残基的位置对应于SEQIDNO：2的氨基酸位置。40.根据权利要求35-38任一项所述的方法，其中与SEQIDNO：2或SEQIDNO：28相比，所述麦芽糖依赖性降解决定子包含至少一组变体氨基酸残基，和其中所述至少一组变体氨基酸残基是选自由以下变体氨基酸残基组组成的组：(a)I10T、V24A、D42V、K43E、D83G、P92T、M149I、Y168N、N186S、A216V、和T357S；(b)I10T、V24A、D42V、K43E、D83G、M149I、Y168N、N186S、A216V、和D237N；(c)I10T、V24A、D42V、K43E、D83G、M149I、Y168N、N186S、A216V、和A339T；(d)I10T、V24A、D42V、K43E、D83G、M149I、Y168N、N186S、A216V、和N242D；(e)I10T、V24A、D42V、A110T、M149I、和A216V；(f)I10T、V24A、D42V、K43E、D83G、M149I、Y168N、N186S、和A216V；(g)L21S、A64T、L136M、Y177H、A187P、A304S、T321N、和A351T；(h)K7R、D83G、V98I、L193S、I236N、和N374S；(i)W11G、D88N、P134S、A135T、D210E、和M322L；(j)I117V、Y168N、G229C、L263M、T367S、和S370P；(k)F68S、W95R、N186S、和D198V；和(l)F28Y、K43E、N101I、Y168C、A217D、和L291V。41.根据权利要求40所述的方法，其中所述麦芽糖依赖性降解决定子包含选自由以下组成的组的序列：(a)SEQIDNOS：4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、和26；(b)SEQIDNOS：16、18、20、22、24、和26的位置1至位置365；和(c)SEQIDNOS：16、18、20、22、24、和26的位置1至位置370。42.根据权利要求22-41任一项所述的方法，其中所述麦芽糖响应型启动子是合成的麦芽糖响应型启动子。43.根据权利要求22-41任一项所述的方法，其中所述麦芽糖响应型启动子包含选自由以下组成的组的序列：pMAL1(SEQIDNO：29)，pMAL2(SEQIDNO：30)，pMAL11(SEQIDNO：31)，pMAL12(SEQIDNO：32)，pMAL31(SEQIDNO：33)，pMAL32(SEQIDNO：34)，pMAL32_v1(SEQIDNO：78)，pGMAL_v5(SEQIDNO：35)，pGMAL_v6(SEQIDNO：36)，pGMAL_v7(SEQIDNO：37)，pGMAL_v9(SEQIDNO：38)，pGMAL_v10(SEQIDNO：39)，pGMAL_v11(SEQIDNO：40)，pGMAL_v12(SEQIDNO：41)，pGMAL_v13(SEQIDNO：42)，pGMAL_v14(SEQIDNO：43)，pGMAL_v15(SEQIDNO：44)，pGMAL_v16(SEQIDNO：45)，pGMAL_v17(SEQIDNO：46)，pGMAL_v18(SEQIDNO：47)，pG2MAL_v1(SEQIDNO：48)，pG2MAL_v2(SEQIDNO：49)，pG2MAL_v3(SEQIDNO：50)，pG2MAL_v5(SEQIDNO：51)，pG2MAL_v6(SEQIDNO：52)，pG2MAL_v7(SEQIDNO：53)，pG2MAL_v8(SEQIDNO：54)，pG2MAL_v9(SEQIDNO：55)，pG2MAL_v10(SEQIDNO：56)，pG7MAL_v2(SEQIDNO：57)，pG7MAL_v4(SEQIDNO：58)，pG7MAL_v6(SEQIDNO：59)，pG7MAL_v8(SEQIDNO：60)，pG7MAL_v9(SEQIDNO：61)，pG172_MAL_v13(SEQIDNO：62)，pG271_MAL_v12(SEQIDNO：63)，pG721_MAL_v11(SEQIDNO：64)，pG712_MAL_v14(SEQIDNO：65)，其保留启动子功能的部分，或与其具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。44.在遗传修饰的宿主细胞中生成异源性非分解代谢化合物的方法，所述方法包括：(a)在包含碳源的培养基中培养遗传修饰的宿主细胞群，所述碳源包含麦芽糖基诱导物，其中所述遗传修饰的宿主细胞包含：(i)一种或多种异源性核酸，所述一种或多种异源性核酸编码用于制备所述异源性非分解代谢化合物的生物合成途径的一种或多种酶；和(ii)编码融合蛋白的异源性核酸，所述融合蛋白包含与麦芽糖依赖性降解决定子框内融合的目的蛋白，所述异源性核酸可操作地连接至麦芽糖响应型启动子，其中在所述麦芽糖基诱导物存在下，编码所述融合蛋白的所述异源性核酸的转录被激活，和由其编码的所述融合蛋白被稳定，和其中所述稳定的融合蛋白调控所述一种或多种酶的表达，其转而控制由所述宿主细胞生成的所述异源性非分解代谢化合物的量；和(b)在包含碳源的培养基中培养所述宿主细胞群或其亚群，其中与步骤(a)中的所述培养基相比，所述麦芽糖基诱导物不存在或以足够低的量存在。45.根据权利要求44所述的方法，其中与步骤(a)相比，步骤(b)中的麦芽糖响应型启动子活性和融合蛋白稳定性降低，与步骤(a)相比其导致由所述遗传修饰的宿主细胞生成的所述异源性非分解代谢化合物的量的变化。46.根据权利要求44或45所述的方法，其中所述目的蛋白是转录调控因子。47.根据权利要求46所述的方法，其中所述转录调控因子负调控编码所述生物合成途径的所述一种或多种酶的所述一种或多种异源性核酸的表达，和在步骤(a)中的所述麦芽糖基诱导物增加所述转录调控因子的表达。48.根据权利要求46或47所述的方法，其中所述转录调控因子是Gal80p。49.根据权利要求48所述的方法，其中所述宿主细胞进一步包含Gal4p，和其中编码所述生物合成途径的所述一种或多种酶的所述一种或多种异源性核酸中的每一种均可操作地连接至Gal4p响应型启动子。50.根据权利要求49所述的方法，其中所述Gal4p响应型启动子是选自由pGAL1、pGAL2、pGAL7、pGAL10、pGCY1、pGAL80和合成的pGAL启动子组成的组。51.根据权利要求44-50任一项所述的方法，其中所述遗传修饰的宿主细胞能够生成类异戊二烯化合物，并包含编码类异戊二烯途径酶的至少一种异源性核酸。52.根据权利要求44-51任一项所述的方法，其中步骤(a)的所述培养基包含至少约0.1％(w/v)的所述麦芽糖基诱导物。53.根据权利要求52所述的方法，其中步骤(a)的所述培养基包含约0.25％至3％(w/v)的所述麦芽糖基诱导物。54.根据权利要求44-53任一项所述的方法，其中步骤(b)的所述培养基包含不超过约0.08％(w/v)的所述麦芽糖基诱导物。55.根据权利要求44-54任一项所述的方法，其中在生成所述异源性非分解代谢化合物过程中，在步骤(b)期间，将所述遗传修饰的宿主细胞群或亚群培养约3至20天的时间。56.根据权利要求44-55任一项所述的方法，其中所述宿主细胞是选自由真菌细胞、细菌细胞、植物细胞、和动物细胞组成的组。57.根据权利要求56所述的方法，其中所述宿主细胞是酵母细胞。58.根据权利要求44-57任一项所述的方法，其中所述融合蛋白中的所述麦芽糖依赖性降解决定子包含与SEQIDNO：2或SEQIDNO：28具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、或95％序列同一性的氨基酸序列，和与SEQIDNO：2或SEQIDNO：28相比，包含至少一个氨基酸变体。59.根据权利要求34-57任一项所述的方法，其中所述融合蛋白中的所述麦芽糖依赖性降解决定子包含与SEQIDNO：2或SEQIDNO：28具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、或95％序列同一性的氨基酸序列，和包含选自由K7R、I10T、W11G、L21S、V24A、F28Y、D42V、K43E、A64T、F68S、D83G、D88N、P92T、W95R、V98I、N101I、A110T、I117V、P134S、A135T、L136M、M149I、Y168C、Y168N、Y177H、N186S、A187P、L193S、D198V、D210E、A216V、A217D、G229C、I236N、D237N、N242D、L263M、L291V、A304S、T321N、M322L、A339T、A351T、T357S、T367S、S370P和N374S组成的组的一个或多个变体氨基酸残基，其中所述一个或多个变体氨基酸残基的位置对应于SEQIDNO：2或SEQIDNO：28的氨基酸位置。60.根据权利要求58或59所述的方法，其中与SEQIDNO：2相比，所述麦芽糖依赖性降解决定子在位置365之后被截短。61.根据权利要求58-60任一项所述的方法，其中所述一个或多个变体氨基酸残基包含I10T、V24A、D42V、M149I和A216V，其中所述变体氨基酸残基的位置对应于SEQIDNO：2的氨基酸位置。62.根据权利要求58-61任一项所述的方法，其中与SEQIDNO：2或SEQIDNO：28相比，所述麦芽糖依赖性降解决定子包含至少一组变体氨基酸残基，和其中所述至少一组变体氨基酸残基是选自由以下变体氨基酸残基组组成的组：(a)I10T、V24A、D42V、K43E、D83G、P92T、M149I、Y168N、N186S、A216V、和T357S；(b)I10T、V24A、D42V、K43E、D83G、M149I、Y168N、N186S、A216V、和D237N；(c)I10T、V24A、D42V、K43E、D83G、M149I、Y168N、N186S、A216V、和A339T；(d)I10T、V24A、D42V、K43E、D83G、M149I、Y168N、N186S、A216V、和N242D；(e)I10T、V24A、D42V、A110T、M149I、和A216V；(f)I10T、V24A、D42V、K43E、D83G、M149I、Y168N、N186S、和A216V；(g)L21S、A64T、L136M、Y177H、A187P、A304S、T321N、和A351T；(h)K7R、D83G、V98I、L193S、I236N、和N374S；(i)W11G、D88N、P134S、A135T、D210E、和M322L；(j)I117V、Y168N、G229C、L263M、T367S、和S370P；(k)F68S、W95R、N186S、和D198V；和(l)F28Y、K43E、N101I、Y168C、A217D、和L291V。63.根据权利要求62所述的方法，其中所述麦芽糖依赖性降解决定子包含选自由以下组成的组的序列：(a)SEQIDNOS：4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、和26；(b)SEQIDNOS：16、18、20、22、24、和26的位置1至位置365；和(c)SEQIDNOS：16、18、20、22、24、和26的位置1至位置370。64.根据权利要求44-63任一项所述的方法，其中所述麦芽糖响应型启动子是合成的麦芽糖响应型启动子。65.根据权利要求44-63任一项所述的方法，其中所述麦芽糖响应型启动子包含选自由以下组成的组的序列：pMAL1(SEQIDNO：29)，pMAL2(SEQIDNO：30)，pMAL11(SEQIDNO：31)，pMAL12(SEQIDNO：32)，pMAL31(SEQIDNO：33)，pMAL32(SEQIDNO：34)，pMAL32_v1(SEQIDNO：78)，pGMAL_v5(SEQIDNO：35)，pGMAL_v6(SEQIDNO：36)，pGMAL_v7(SEQIDNO：37)，pGMAL_v9(SEQIDNO：38)，pGMAL_v10(SEQIDNO：39)，pGMAL_v11(SEQIDNO：40)，pGMAL_v12(SEQIDNO：41)，pGMAL_v13(SEQIDNO：42)，pGMAL_v14(SEQIDNO：43)，pGMAL_v15(SEQIDNO：44)，pGMAL_v16(SEQIDNO：45)，pGMAL_v17(SEQIDNO：46)，pGMAL_v18(SEQIDNO：47)，pG2MAL_v1(SEQIDNO：48)，pG2MAL_v2(SEQIDNO：49)，pG2MAL_v3(SEQIDNO：50)，pG2MAL_v5(SEQIDNO：51)，pG2MAL_v6(SEQIDNO：52)，pG2MAL_v7(SEQIDNO：53)，pG2MAL_v8(SEQIDNO：54)，pG2MAL_v9(SEQIDNO：55)，pG2MAL_v10(SEQIDNO：56)，pG7MAL_v2(SEQIDNO：57)，pG7MAL_v4(SEQIDNO：58)，pG7MAL_v6(SEQIDNO：59)，pG7MAL_v8(SEQIDNO：60)，pG7MAL_v9(SEQIDNO：61)，pG172_MAL_v13(SEQIDNO：62)，pG271_MAL_v12(SEQIDNO：63)，pG721_MAL_v11(SEQIDNO：64)，pG712_MAL_v14(SEQIDNO：65)，其保留启动子功能的部分，和与其具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。66.在遗传修饰的宿主细胞中生成非分解代谢化合物的方法，所述方法包括：(a)在包含碳源的培养基中培养遗传修饰的宿主细胞群，所述碳源包含麦芽糖基诱导物，其中所述遗传修饰的宿主细胞包含：(i)编码生物合成途径的一种或多种酶的一种或多种异源性核酸，所述一种或多种异源性核酸各自可操作地连接至Gal4p响应型启动子；(ii)编码Gal4p的核酸；和(iii)编码融合蛋白的核酸，所述融合蛋白包含与麦芽糖依赖性降解决定子框内融合的Gal80p，所述核酸可操作地连接至麦芽糖响应型启动子，其中所述培养基中的所述麦芽糖基诱导物限制由所述宿主细胞生成的异源性非分解代谢化合物的量；和(b)在包含碳源的培养基中培养所述宿主细胞群或其亚群，其中与步骤(a)中的所述培养基相比，所述麦芽糖基诱导物不存在或以足够低的量存在。67.根据权利要求66所述的方法，其中所述Gal4p响应型启动子是选自由pGAL1、pGAL2、pGAL7、pGAL10、pGCY1、pGAL80、和合成的pGAL启动子组成的组。68.根据权利要求66或67所述的方法，其中所述麦芽糖依赖性降解决定子包含与SEQIDNO：2或SEQIDNO：28具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、或95％序列同一性的氨基酸序列，和与SEQIDNO：2或SEQIDNO：28相比，包含一个或多个变体氨基酸残基。69.根据权利要求68所述的方法，其中所述一个或多个变体氨基酸残基是选自由K7R、I10T、W11G、L21S、V24A、F28Y、D42V、K43E、A64T、F68S、D83G、D88N、P92T、W95R、V98I、N101I、A110T、I117V、P134S、A135T、L136M、M149I、Y168C、Y168N、Y177H、N186S、A187P、L193S、D198V、D210E、A216V、A217D、G229C、I236N、D237N、N242D、L263M、L291V、A304S、T321N、M322L、A339T、A351T、T357S、T367S、S370P和N374S组成的组，其中所述一个或多个变体氨基酸残基的位置对应于SEQIDNO：2或SEQIDNO：28的氨基酸位置。70.根据权利要求68或69所述的方法，其中与SEQIDNO：2相比，所述麦芽糖依赖性降解决定子在位置365之后被截短。71.根据权利要求68-70任一项所述的方法，其中所述一个或多个变体氨基酸残基包含I10T、V24A、D42V、M149I和A216V，和其中所述一个或多个变体氨基酸残基的位置对应于SEQIDNO：2的氨基酸位置。72.根据权利要求68-70任一项所述的方法，其中与SEQIDNO：2或SEQIDNO：28相比，所述麦芽糖依赖性降解决定子包含至少一组变体氨基酸残基，和其中所述至少一组变体氨基酸残基是选自由以下变体氨基酸残基组组成的组：(a)I10T、V24A、D42V、K43E、D83G、P92T、M149I、Y168N、N186S、A216V、和T357S；(b)I10T、V24A、D42V、K43E、D83G、M149I、Y168N、N186S、A216V、和D237N；(c)I10T、V24A、D42V、K43E、D83G、M149I、Y168N、N186S、A216V、和A339T；(d)I10T、V24A、D42V、K43E、D83G、M149I、Y168N、N186S、A216V、和N242D；(e)I10T、V24A、D42V、A110T、M149I、和A216V；(f)I10T、V24A、D42V、K43E、D83G、M149I、Y168N、N186S、和A216V；(g)L21S、A64T、L136M、Y177H、A187P、A304S、T321N、和A351T；(h)K7R、D83G、V98I、L193S、I236N、和N374S；(i)W11G、D88N、P134S、A135T、D210E、和M322L；(j)I117V、Y168N、G229C、L263M、T367S、和S370P；(k)F68S、W95R、N186S、和D198V；和(l)F28Y、K43E、N101I、Y168C、A217D、和L291V。73.根据权利要求72所述的方法，其中所述麦芽糖依赖性降解决定子包含选自由以下组成的组的序列：(a)SEQIDNOS：4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、和26；(b)SEQIDNOS：16、18、20、22、24、和26的位置1至位置365；和(c)SEQIDNOS：16、18、20、22、24、和26的位置1至位置370。74.根据权利要求66-73任一项所述的方法，其中所述麦芽糖响应型启动子是合成的麦芽糖响应型启动子。75.根据权利要求66-73任一项所述的方法，其中所述麦芽糖响应型启动子包含选自由以下组成的组的序列：pMAL1(SEQIDNO：29)，pMAL2(SEQIDNO：30)，pMAL11(SEQIDNO：31)，pMAL12(SEQIDNO：32)，pMAL31(SEQIDNO：33)，pMAL32(SEQIDNO：34)，pMAL32_v1(SEQIDNO：78)，pGMAL_v5(SEQIDNO：35)，pGMAL_v6(SEQIDNO：36)，pGMAL_v7(SEQIDNO：37)，pGMAL_v9(SEQIDNO：38)，pGMAL_v10(SEQIDNO：39)，pGMAL_v11(SEQIDNO：40)，pGMAL_v12(SEQIDNO：41)，pGMAL_v13(SEQIDNO：42)，pGMAL_v14(SEQIDNO：43)，pGMAL_v15(SEQIDNO：44)，pGMAL_v16(SEQIDNO：45)，pGMAL_v17(SEQIDNO：46)，pGMAL_v18(SEQIDNO：47)，pG2MA...

【专利技术属性】
技术研发人员：PR蔡，江汉笑，AL梅多斯，
申请(专利权)人：阿迈瑞斯公司，道达尔市场服务公司，
类型：发明
国别省市：美国,US