从3-甲基巴豆酸生产异丁烯的方法技术

描述了用于生产异丁烯的方法，其包括将3‑甲基巴豆酸酶促转化成异丁烯，其中通过将3‑甲基巴豆酰辅酶A酶促转化为3‑甲基巴豆酸获得所述3‑甲基巴豆酸或其中通过将3‑羟基异戊酸(HIV)酶促转化成3‑甲基巴豆酸获得所述3‑甲基巴豆酸。描述了可以例如通过利用3‑甲基巴豆酸脱羧酶，优选与FMN异戊烯转移酶相关的FMN依赖性脱羧酶，乌头酸脱羧酶(EC 4.1.1.6)，甲基巴豆酰辅酶A羧化酶(EC 6.4.1.4)或香叶酰辅酶A羧化酶(EC 6.4.1.5)实现3‑甲基巴豆酸到异丁烯的酶促转化。

The method of producing isobutene from 3- methyl soy bean acid

A method for the production of isobutene is described, which includes the conversion of 3 polymethyl methoate enzyme into isobutene, in which the 3 methyl bar acid is obtained by converting the 3 methyl methyl coenzyme A enzyme into 3 polymethylmethy acid or by converting 3 hydroxyisovaleric acid (HIV) into 3 polymethyl soy bean acid to obtain the 3 Methyl soy bean acid. The enzymatic conversion of FMN dependent decarboxylase, aconitate decarboxylase (EC 4.1.1.6), methanoyl coenzyme A carboxylase (EC 6.4.1.4) or xanolacyl coenzyme A carboxylase (EC 6.4.1.5), which can be optimized for FMN isoamyl acetate decarboxylase, can be optimized, for example, with the enzyme related to FMN isoamyl transferase. .

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】从3-甲基巴豆酸生产异丁烯的方法本专利技术涉及生产异丁烯的方法，其包括将3-甲基巴豆酸酶促转化为异丁烯，其中所述3-甲基巴豆酸通过将3-甲基巴豆酰辅酶A酶促转化为3-甲基巴豆酸而获得或其中所述3－甲基巴豆酸通过将3-羟基异戊酸(HIV)酶促转化为3-甲基巴豆酸而获得。3-甲基巴豆酸到异丁烯的酶促转化可以例如通过利用3-甲基巴豆酸脱羧酶，优选与FMN异戊烯转移酶，乌头酸脱羧酶(EC4.1.1.6)，甲基巴豆酰辅酶A羧化酶(EC6.4.1.4)或香叶酰辅酶A羧化酶(EC6.4.1.5)相关的FMN依赖性脱羧酶来实现。此外，所述3-甲基巴豆酰辅酶A可通过将3-甲基戊烯二酰辅酶A酶促转化成3-甲基巴豆酰辅酶A而获得。许多的化学化合物目前源自石油化学品。烯类(如乙烯、丙烯、不同的丁烯或例如其他戊烯)在例如用于产生聚丙烯或聚乙烯的塑料工业和在化学工业其他领域和燃料领域中使用。丁烯以四种形式存在，其中之一，异丁烯(又称作异丁烯)，进入甲基叔丁基醚(MTBE)(汽车燃料用抗爆添加剂)的组合物中。异丁烯也可以用来产生异辛烯，所述异辛烯转而可以还原成异辛烷(2,2,4-三甲基戊烷)；异辛烷的极高辛烷值使其成为所谓“汽油”发动机的最佳燃料。烯类如异丁烯目前通过催化性裂解石油产物(或在己烯的情况下从煤炭或天然气中通过Fischer-Tropsch法的衍生物)产生。生产成本因此与油价紧密相关。另外，催化性裂解有时与增加工艺复杂性和生产成本的巨大技术难题相关。在与地球化学循环和谐相处的可持续工业运营背景下，需要通过生物途径生产烯类如异丁烯。由于发酵和蒸馏过程已经在食品加工产业中存在，第一代生物燃料由乙醇的发酵生产组成。第二代生物燃料的生产处于探索期，尤其包括生产长链醇(丁醇和戊醇)、萜烯、直链链烷和脂肪酸。两份最新综述提供了这个领域中研究的总体概述：Ladygina等人(ProcessBiochemistry41(2006),1001)和Wackett(CurrentOpinionsinChemicalBiology21(2008),187)。已经描述异戊酸由小红酵母(Rhodotorulaminuta)转化成异丁烯(Fujii等人(Appl.Environ.Microbiol.54(1988),583))，但是但是这种反应的效率，小于每分钟百万分之一或每天约1/1000，远未允许工业应用。反应机理由FukudaH等人(BBRC201(1994),516)阐明并且涉及通过还原氧代铁基(oxoferryl)FeV＝O，使异戊酸脱羧的细胞色素P450酶。通过该途径的异丁烯的大规模生物合成似乎是非常不利的，因为它需要合成和降解一个亮氨酸分子以形成一个异丁烯分子。此外，催化反应的酶使用血红素作为辅因子，其本身不利于细菌中的重组表达和改善酶参数。出于全部这些原因，似乎很不可能的是，这种途径可以充当工业利用的基础。已经将其他微生物描述为能够略微地从异戊酸盐天然产生异丁烯；获得的产率甚至低于用小红酵母获得的那些产率(Fukuda等人(Agric.Biol.Chem.48(1984),1679))。Gogerty等人(Appl.Environm.Microbiol.76(2010),8004-8010)和vanLeeuwen等人(Appl.Microbiol.Biotechnol.93(2012),1377-1387)描述通过酶促转化从乙酰乙酰辅酶A产生异丁烯，其中所提出途径的最后步骤是通过利用甲羟戊酸二磷酸脱羧酶转化3-羟基-3-甲基丁酸(也称作3-羟异戊酸(HIV))。WO2010/001078中也描述了从3-羟基-3-甲基丁酸产生异丁烯的这种反应。在Gogerty等人(上述引文)和vanLeeuwen等人(见上述引文)中，提出3-羟基-3-甲基丁酸的生产是通过3-甲基巴豆酰辅酶A经3-羟基-3-甲基丁酰辅酶A的转化来实现的。为了进一步提高由可再生资源生产异丁烯的方法的效率和可变性，需要提供异丁烯及其前体的备选途径。本专利技术通过提供一种生产异丁烯的方法来满足这一要求，该方法包括将3-甲基巴豆酸(也称为3-甲基-2-丁烯酸)酶促转化为异丁烯。3-甲基巴豆酸到异丁烯的酶促转化是脱羧反应。脱羧是去除羧基并释放二氧化碳(CO2)的化学反应。US-A1-2009/0092975中已经提出了3-甲基巴豆酸的脱羧，但没有关于该转化的实验证据。在US-A1-2009/0092975中，描述了来自酿酒酵母的称为PAD1的核酸序列，并且公开其编码脱羧酶。该酶被认为可用作重组生物中的选择性标记，而它被描述为可使用“弱酸”作为选择剂。3-甲基巴豆酸等许多其他酸被称为潜在的“弱酸”。然而，后来才发现上述PAD1实际上不提供脱羧酶活性。事实上，细菌ubiD和ubiX或同源真核生物fdc1和pad1基因已经涉及非氧化性可逆脱羧。苯基丙烯酸脱羧酶(PAD)和阿魏酸脱羧酶(FDC)的联合作用被认为对于酿酒酵母中苯基丙烯酸的脱羧是必不可少的(J.Biosci.Bioeng.109,(2010),564-569；AMBExpress,5:12(2015)1-5；ACSChem.Biol.10(2015),1137-1144)。最近，被描述为苯基丙烯酸脱羧酶(PAD)的上述酶家族被表征为FMN异戊烯转移酶并且不再是脱羧酶。已经表明，Fdc1(但不是PAD)完全负责可逆的脱羧酶活性，并且它需要一种新型辅因子，即由相关的UbiX(或Pad1)蛋白合成的异戊烯化黄素。因此，该PAD酶的真正酶活性已被鉴定为具有异戊二烯部分(来自二甲基烯丙基磷酸或焦磷酸，称为DMAP或DMAPP)的黄素单核苷酸(FMN)辅因子的转化。因此，与现有技术的观点相反，真正的脱羧酶是与修饰的FMN(异戊二烯化的FMN)结合的阿魏酸脱羧酶(FDC)。最近描述了阿魏酸脱羧酶(FDC)与修饰的FMN(异戊二烯化-FMN)(后者由PAD酶提供)相关的这种机制，并涉及令人惊讶的酶促机制，即通过1,3-偶极环加成进行α，β-不饱和酸脱羧。此外，该FDC脱羧酶的结构最近已被阐明(Nature522(2015),497-501；Nature,522(2015),502-505；Appl.Environ.Microbiol.81(2015),4216-4223)。上述US-A1-2009/0092975中描述了用于将α-β不饱和羧酸转化成末端链烯烃的上述酶家族的应用，而WO2012/018624涉及生物合成芳族化合物2,4-戊二烯酸和1,3-丁二烯的微生物和方法，WO2013/028519涉及用于生产2,4-戊二烯酸，丁二烯，丙烯，1,3-丁二醇和相关醇的微生物和方法。此外，WO2013/186215描述了用于制备单不饱和烯烃的方法，其包括使脂族单不饱和羧酸与Fdc1多肽和Pad1多肽接触。然而，在WO2013/186215中，Fdc1多肽和Pad1多肽均被分类为具有脱羧酶活性的酶。相反，在本专利技术中，上述酶是以最终导致产生异丁烯的途径人工实施的。因此，在一个主要方面，本专利技术涉及一种生产异丁烯的方法，其包括将3-甲基巴豆酸酶促转化为异丁烯(步骤I，如图1所示)，其中所述方法进一步包括(a)通过将3-甲基巴豆酰辅酶A酶促转化本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种生产异丁烯的方法，其包括将3‑甲基巴豆酸酶促转化为异丁烯，其中所述方法进一步包括(a)通过将3‑甲基巴豆酰辅酶A酶促转化成3‑甲基巴豆酸来提供3‑甲基巴豆酸，或(b)通过将3‑羟基异戊酸(HIV)酶促转化成3‑甲基巴豆酸来提供3‑甲基巴豆酸。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.11.17 EP 15194984.91.一种生产异丁烯的方法，其包括将3-甲基巴豆酸酶促转化为异丁烯，其中所述方法进一步包括(a)通过将3-甲基巴豆酰辅酶A酶促转化成3-甲基巴豆酸来提供3-甲基巴豆酸，或(b)通过将3-羟基异戊酸(HIV)酶促转化成3-甲基巴豆酸来提供3-甲基巴豆酸。2.权利要求1的方法，其中通过使用3-甲基巴豆酸脱羧酶实现3-甲基巴豆酸到异丁烯的酶促转化。3.权利要求2的方法，其中所述3-甲基巴豆酸脱羧酶是：(i)与FMN异戊烯转移酶相关的FMN依赖性脱羧酶；或(ii)乌头酸脱羧酶(EC4.1.1.6)；或(iii)甲基巴豆酰辅酶A羧化酶(EC6.4.1.4)；或(iv)香叶酰辅酶A羧化酶(EC6.4.1.5)；或(v)原儿茶酸(PCA)脱羧酶(EC4.1.1.63)。4.权利要求1至3中任一项所述的方法，其中3-甲基巴豆酰辅酶A到3-甲基巴豆酸的酶促转化通过如下实现(a)单个酶促反应，其中通过利用辅酶A转移酶(EC2.8.3.-)，优选丙酸：乙酸-辅酶A转移酶(EC2.8.3.1)，乙酸辅酶A转移酶(EC2.8.3.8)或琥珀酰辅酶A：乙酸辅酶A转移酶(EC2.8.3.18)将3-甲基巴豆酰辅酶A直接转化成3-甲基巴豆酸；(b)单个酶促反应，其中通过利用硫酯水解酶(EC3.1.2.-)，优选乙酰辅酶A水解酶(EC3.1.2.1)，依赖于ADP的短链酰基辅酶A水解酶(EC3.1.2.18)或酰基辅酶A水解酶(EC3.1.2.20)将3-甲基巴豆酰辅酶A直接转化为3-甲基巴豆酸；或(c)两个酶促步骤，其包含(i)首先将3-甲基巴豆酰辅酶A酶促转化为3-甲基巴豆酰磷酸；和(ii)然后将由此获得的3-甲基巴豆酰磷酸酶促转化成所述3-甲基巴豆酸。5.权利要求4(c)所述的方法，其中通过利用磷酸丁酰转移酶(EC2.3.1.19)或磷酸乙酰转移酶(EC2.3.1.8)实现所述3-甲基巴豆酰辅酶A到3-甲基巴豆酰磷酸的酶促转化，并且通过利用用羧基作为受体的磷酸转移酶(EC2.7.2.-)，优选丙酸激酶(EC2.7.2.15)，乙酸激酶(EC2.7.2.1)，丁酸激酶(EC2.7.2.7)或支链脂肪酸激酶(EC2.7.2.14)实现所述3-甲基巴豆酰磷酸向所述3-甲基巴豆酸的酶促转化。6.权利要求1至5中任一项所述的方法，所述方法还包括通过将3-甲基戊烯二酰辅酶A酶促转化成3-甲基巴豆酰辅酶A来提供所述3-甲基巴豆酰辅酶A。7.权利要求6所述的方法，其中3-甲基戊烯二酰辅酶A到3-甲基巴豆酰辅酶A的酶促转化通过利用以下酶实现：(i)甲基巴豆酰辅酶A羧化酶(EC6.4.1.4)；或(ii)香叶酰辅酶A羧化酶(EC6.4.1.5)。8.权利要求1至7中任一项所述的方法，所述方法还包括通过将3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A酶促转化成3-甲基戊烯二酰辅酶A来提供所述3-甲基戊烯二酰辅酶A。9.权利要求8的方法，其中通过利用3-甲基戊烯二酰-辅酶A水合酶(EC4.2.1.18)，3-羟酰基辅酶A脱水酶(EC4.2.1.-)或烯酰辅酶A水合酶(EC4.2.1.-)实现3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A到3-甲基戊烯二酰辅酶A的酶促转化。10.权利要求1至9中任一项所述的方法，所述方法还包括通过乙酰乙酰辅酶A和乙酰辅酶A酶促缩合成3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A来提供3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A。11.权利要求10的方法，其中通过使用3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶实现乙酰乙酰辅酶A和乙酰辅酶A酶促缩合成3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A。12.权利要求1至3...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·阿拉尔，M·阿尼斯莫瓦，P·马利埃，
申请(专利权)人：环球生物能源公司，财富科学家股份有限公司，
类型：发明
国别省市：法国,FR