使用AOBGL3同源体的甜菊醇糖苷及甜菊醇的制造方法技术

本发明专利技术在于提供一种甜菊醇糖苷及/或甜菊醇的制备方法，其包括使糖苷酶AOBGL1及/或AOBGL3或其突变体与具有至少1个单葡萄糖苷键及/或单葡萄糖基酯键的甜菊醇糖苷反应，从而剪切所述单葡萄糖苷键及/或单葡萄糖基酯键的工序。

Preparation of steviol glycosides and steviol using AOBGL3 homologue

The present invention provides a preparation method of stevioside and / or steviol, which includes the process of making the glucosidase AOBGL1 and / or AOBGL3 or its mutants reacting with steviol glycosides with at least 1 single glucoside bonds and / or mono glucoside ester bonds to cut the single glucose glycoside bond and / or the single glucosyl ester bond.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用AOBGL3同源体的甜菊醇糖苷及甜菊醇的制造方法
本专利技术涉及甜菊醇糖苷及甜菊醇的制造方法。
技术介绍
在菊科甜菊(Steviarebaudiana)的叶中包含二萜的一种的被称作甜菊醇(Steviol)的次级代谢产物，在甜菊醇上附加了糖的甜菊醇糖苷中呈现砂糖的约300倍的甜味，它们作为低热量的甜味剂在食品产业中被利用。肥胖作为深刻的社会问题在国际上日益严峻，从增进健康及削减医疗费的观点出发低热量甜味剂的需求也日益增大。目前，人工合成的氨基酸衍生物阿斯巴甜(Aspartame)、乙酰磺胺酸钾(AcesulfamePotassium)作为人工甜味剂被利用，而像甜菊醇糖苷这样天然存在的低热量甜味剂更为安全，从而可期待能够更容易得到消费者理解(PublicAcceptance)。甜菊醇糖苷中的甜菊苷为在甜菊醇上附加了3个葡萄糖的化合物，一般在甜菊的叶中包含最多。甜菊苷具有蔗糖的大约300倍的甜味度但呈现些许苦味。甜菊醇糖苷的瑞鲍迪甙A为在甜菊醇上附加了4个葡萄糖的化合物，具有蔗糖的大约400倍的甜味度。甜菊苷与瑞鲍迪甙A为甜菊甜味的核心物质。另外，还已知有在甜菊醇上附加了5个葡萄糖的瑞鲍迪甙D、附加了6个葡萄糖的瑞鲍迪甙M等糖苷。另外，已知甜茶中包含在甜菊醇的13位与19位分别各附加了1个葡萄糖的甜茶苷，其为甜茶主要的甜味成分。除此以外，已知存在认为是反应中间体的糖苷或根据糖的种类而不同的类似物(图1)。另一方面，关于甜菊醇已知有认知功能的改善效果等。在甜菊醇糖苷中，只要能够利用仅作用于特定的糖苷键的酶，则可生产特定的糖苷或除去不需要的糖苷，从而甜菊提取物味质的改善、特定的甜菊醇糖苷的纯化变得容易等的优点明显。关于水解甜菊醇糖苷的酶活性，在几个生物种类中有报道。其中，关于曲霉属丝状菌生成甜菊醇糖苷水解酶，报道了在生酱油中具有将甜菊苷水解成甜茶苷的活性(非专利文献1)、在Pectinase酶制剂或Hesperidinase酶制剂、Takadiastase酶制剂中具有将甜菊苷水解成甜菊醇的活性(非专利文献2-4)。另外，报道了通过组合使用来自曲霉属丝状菌的果胶酶制剂与来自蜗牛(Helixpomatia)的酶制剂从而由甜菊苷制造甜菊醇的方法(专利文献1)。记载了在来自Aspergillusaculeatus的酶制剂ViscozymeL(novozyme)中，具有水解成为甜菊苷→甜茶苷→甜菊醇单糖基酯的活性(非专利文献5)。另外，记载了在Aspergillusaculeatus的个体培养提取物中具有将甜菊苷转变为甜菊醇的活性(非专利文献6)。如上所述，虽然提示了包含曲菌的曲霉属丝状菌存在具有甜菊醇糖苷水解活性的酶基因，但是并没有关于承担酶活性的基因或酶的报道。另外，存在曲菌的AO090009000356基因所编码的糖苷水解酶(GH)3家族的β-糖苷酶水解具有β-糖苷键的二糖类的报道(非专利文献7)。具体而言，按照具有β-1,3键的昆布二糖、具有β-1,6键的β-龙胆二糖、具有β-1,4键的纤维二糖、具有β-1,2键的槐糖的顺序，水解的特异性高。然而，并没有报道是否具有水解以甜菊醇糖苷为代表的萜烯糖苷的活性。在除此以外的生物中也报道了具有水解甜菊醇糖苷的活性。例如，公开了甲米菌属细菌具有分解甜茶苷的19位葡萄糖基酯键但无法分解13位糖苷键的酶(专利文献2)。另外，报道了来自Flavobacteriumjohnsonae的β-糖苷酶具有分解甜菊醇糖苷的活性(水解13位β-糖苷键与19位葡萄糖基酯键的活性)。然而，虽然发现了它们中的任一个均具有水解甜菊醇糖苷的活性，但并没有鉴定出承担其活性的基因。进而，在曲菌中认为存在很多编码具有β-糖苷酶样活性的GH3家族酶、GH5家族酶的基因，即使可检测酶活性，但鉴定哪个基因承担其活性并不容易。现有技术文献专利文献专利文献1：日本特表2013-516963号公报专利文献2：日本特开平10-276775号公报专利文献3：日本特开平10-276775号公报非专利文献非专利文献1：日本食品工业学会志第37卷第5号369-374(1990)非专利文献2：Phytochemistry,6,1107(1967)非专利文献3：药志,95,1507(1975)非专利文献4：日化志,1981,726(1981)非专利文献5：J.Agric.FoodChem.,60,6210-6216(2012)非专利文献6：WeiShengWuXueBao,54(1),62-68(2014)非专利文献7：BiochimBiophysActa.,1764972-978(2006)
技术实现思路
在上述这样的情况下，寻求甜菊醇糖苷及甜菊醇的新生产方法。本专利技术者为了解决上述课题进行了深入研究，结果发现AOBGL3基因编码的来自曲菌的糖苷水解酶同源体蛋白质具有水解甜菊醇糖苷的活性。即发现了具有剪切甜菊醇糖苷的单葡萄糖苷及/或单葡萄糖基酯的活性等，从而完成了本专利技术。进而，通过合并表达来自曲菌的AOBGL1基因所编码的其他糖苷酶同源体蛋白质，可生成甜菊醇糖苷及/或甜菊醇，从而完成了本专利技术。即，本专利技术如下所示。[1]一种甜菊醇糖苷及/或甜菊醇的制备方法，其特征在于，包括使选自以下(a)～(c)的蛋白质与具有至少1个单葡萄糖苷键及/或单葡萄糖基酯键的甜菊醇糖苷反应，从而剪切所述单葡萄糖苷键及/或单葡萄糖基酯键的工序，(a)由序列号3或4的氨基酸序列构成的蛋白质；(b)由序列号3或4的氨基酸序列中1～77个氨基酸发生缺失、取代、插入、及/或附加的氨基酸序列构成且具有剪切单葡萄糖苷键及/或单葡萄糖基酯键活性的蛋白质；(c)具有相对于序列号3或4的氨基酸序列具有90％以上的序列同一性的氨基酸序列，且具有剪切甜菊醇糖苷的单葡萄糖苷键及/或单葡萄糖基酯键活性的蛋白质。[2]根据所述[1]所述的方法，其特征在于，所述具有至少1个单葡萄糖苷键及/或单葡萄糖基酯键的甜菊醇糖苷选自瑞鲍迪甙A、甜菊苷、甜茶苷、甜菊醇单糖苷及甜菊醇单葡萄糖基酯。[3]根据所述[2]所述的方法，其特征在于，不具有所述单葡萄糖苷键及/或单葡萄糖基酯键的甜菊醇糖苷为甜茶苷。[4]一种不具有单葡萄糖苷键及/或单葡萄糖基酯键的甜菊醇糖苷及/或甜菊醇的生产方法，其特征在于，包括在生成具有至少1个单葡萄糖苷键及/或单葡萄糖基酯键的甜菊醇糖苷的宿主中将导入有选自以下(a)～(e)的多核苷酸的非人转化体进行培养的工序，(a)由序列号1的碱基序列构成的多核苷酸；(b)编码由序列号3或4的氨基酸序列构成的蛋白质的多核苷酸；(c)多核苷酸，其编码由序列号3或4的氨基酸序列中1～77个氨基酸发生缺失、取代、插入、及/或附加的氨基酸序列构成且具有剪切甜菊醇糖苷的单葡萄糖苷键及/或单葡萄糖基酯键活性的蛋白质；(d)多核苷酸，其编码具有相对于序列号3或4的氨基酸序列具有90％以上的序列同一性的氨基酸序列且具有剪切甜菊醇糖苷的单葡萄糖苷键及/或单葡萄糖基酯键活性的蛋白质；(e)多核苷酸，其与如下多核苷酸在高严谨条件下杂交，且编码具有剪切甜菊醇糖苷的单葡萄糖苷键及/或单葡萄糖基酯键的活性的蛋白质，该多核苷酸由与由序列号1的碱基序列构成的多核苷酸互补的碱基序列构成。[5]根据所述[4]所述的方法，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种甜菊醇糖苷及/或甜菊醇的制备方法，其特征在于，包括使选自以下(a)～(c)的蛋白质与具有至少1个单葡萄糖苷键及/或单葡萄糖基酯键的甜菊醇糖苷反应，从而剪切所述单葡萄糖苷键及/或单葡萄糖基酯键的工序，(a)由序列号3或4的氨基酸序列构成的蛋白质；(b)由序列号3或4的氨基酸序列中1～77个氨基酸发生缺失、取代、插入及/或附加的氨基酸序列构成，且具有剪切单葡萄糖苷键及/或单葡萄糖基酯键活性的蛋白质；(c)具有相对于序列号3或4的氨基酸序列具有90％以上的序列同一性的氨基酸序列，且具有剪切甜菊醇糖苷的单葡萄糖苷键及/或单葡萄糖基酯键活性的蛋白质。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.10.30 JP 2015-2142561.一种甜菊醇糖苷及/或甜菊醇的制备方法，其特征在于，包括使选自以下(a)～(c)的蛋白质与具有至少1个单葡萄糖苷键及/或单葡萄糖基酯键的甜菊醇糖苷反应，从而剪切所述单葡萄糖苷键及/或单葡萄糖基酯键的工序，(a)由序列号3或4的氨基酸序列构成的蛋白质；(b)由序列号3或4的氨基酸序列中1～77个氨基酸发生缺失、取代、插入及/或附加的氨基酸序列构成，且具有剪切单葡萄糖苷键及/或单葡萄糖基酯键活性的蛋白质；(c)具有相对于序列号3或4的氨基酸序列具有90％以上的序列同一性的氨基酸序列，且具有剪切甜菊醇糖苷的单葡萄糖苷键及/或单葡萄糖基酯键活性的蛋白质。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述具有至少1个单葡萄糖苷键及/或单葡萄糖基酯键的甜菊醇糖苷选自瑞鲍迪甙A、甜菊苷、甜茶苷、甜菊醇单糖苷及甜菊醇单葡萄糖基酯。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，不具有所述单葡萄糖苷键及/或单葡萄糖基酯键的甜菊醇糖苷为甜茶苷。4.一种不具有单葡萄糖苷键及/或单葡萄糖基酯键的甜菊醇糖苷及/或甜菊醇的生产方法，其特征在于，包括在生成具有至少1个单葡萄糖苷键及/或单葡萄糖基酯键的甜菊醇糖苷的宿主中将导入有选自以下(a)～(e)的多核苷酸的非人转化体进行培养的工序，(a)由序列号1的碱基序列构成的多核苷酸；(b)编码由序列号3或4的氨基酸序列构成的蛋白质的多核苷酸；(c)多核苷酸，其编码由序列号3或4的氨基酸序列中1～77个氨基酸发生缺失、取代、插入及/或附加的氨基酸序列构成且具有剪切单葡萄糖苷键及/或单葡萄糖基酯键活性的蛋白质；(d)多核苷酸，其编码具有相对于序列号3或4的氨基酸序列具有90％以上的序列同一性的氨基酸序列且具有剪切甜菊醇糖苷的单葡萄糖苷键及/或单葡萄糖基酯键活性的蛋白质；(e)多核苷酸，其与如下多核苷酸在高严谨条件下杂交且编码具有剪切甜菊醇糖苷的单葡萄糖苷键及/或单葡萄糖基酯键的活性的蛋白质，该多核苷酸由与由序列号1的碱基序列构成的多核苷酸互补的碱基序列构成。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述多核苷酸插入在表达载体中。6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述转化体为转化曲菌、转化酵母或转化植物。7.一种不具有单葡萄糖苷键及/或单葡萄糖基酯键的甜菊醇糖苷及/或甜菊醇的制备方法，其特征在于，包括在宿主细胞中使来自导入有选自以下(a)～(e)的多核苷酸的非人转化细胞的酶制剂与具有至少1个单葡萄糖苷键及/或单葡萄糖基酯键的甜菊醇糖苷接触，从而剪切所述单葡萄糖苷键及/或单葡萄...

【专利技术属性】
技术研发人员：落合美佐，小埜栄一郎，
申请(专利权)人：三得利控股株式会社，
类型：发明
国别省市：日本,JP