The present invention relates to a preparation method and application of piperacillin monoclonal antibody. The preparation method includes preparation of piperacillin monoclonal antibody, purification of antibody, identification of antibody purity and identification of antibody titer. The prepared monoclonal antibody against piperacillin was used for the detection of piperacillin drug antibody. The blood of the tested subjects was taken as the test sample. If there was piperacillin antibody in the plasma, the antibody agglutinated by the combination of piperacillin drug antigen on the piperacillin-treated cells bridged by anti-IgG+C3d and under the action of centrifugal force. No agglutination occurs if there is no antibody in the plasma or no drug antigen on the cell surface. Under centrifugal force, it can be deposited in the bottom of the gel pore through the gel gap, showing a negative reaction.
【技术实现步骤摘要】
哌拉西林单克隆抗体的制备方法及应用
本专利技术属于生物
，更具体的是涉及利用杂交瘤技术制备哌拉西林单克隆抗体，并将研制的单克隆抗体应用于临床。
技术介绍
在临床治疗过程中使用药物，特别是使用抗生素类药物时，机体除了会产生药物耐受之外，还有可能产生针对此种药物的抗药物抗体。当机体产生抗药物抗体之后，药物、抗药物抗体及红细胞会形成一种免疫复合物，导致机体对红细胞的破坏清除，引起免疫溶血性贫血、药物使用无效以致危及患者生命安全。虽然产生抗药物抗体的几率很低，但至今为止己报道有超过100种药物可以引发抗药物抗体的产生。随着科技的进步及医药产业的发展，越来越多的药物会投入使用。因此，建立一种有效的检测抗药物抗体的方法，对药物引发的免疫溶血性贫血的检测，病因的确定，指导用药等方面都有着重要的意义。哌拉西林是为数不多的对绿脓杆菌有强抗菌作用的抗生素，因此被广泛应用于临床。然而，患者在临床治疗过程中使用哌拉西林时，一些患者可能产生针对此种药物的抗体。患者一旦产生抗哌拉西林的抗体，该抗体与哌拉西林药物形成的抗原抗体复合体会中和抑制哌拉西林药物的药效，使得哌拉西林药物的疗效得不...
【技术保护点】
1.一种哌拉西林单克隆抗体的制备方法，其特征在于：利用杂交瘤细胞株制备，具体步骤如下：1.1饲养细胞的制备：取6‑10周龄Balb/c小鼠，拉颈处死，浸泡于酒精内，消毒3‑5min；转入无菌操作台中，用无菌剪刀剪开皮肤，使其腹膜充分暴露；用无菌注射器注入预冷的无血清1640培养液，用轻轻拍动小鼠腹腔，吸出培养液，放入离心管，离心；弃掉上清，用完全培养液重悬饲养细胞，计数，并调整细胞数至2×105个/mL，将饲养细胞加入96孔板中，每孔100μL，然后放入37℃的CO2培养箱培养；1.2杂交瘤细胞融合及有限稀释法亚克隆筛选a.制备免疫B细胞：将免疫后的小鼠摘眼球放血，收集血液...
【技术特征摘要】
1.一种哌拉西林单克隆抗体的制备方法，其特征在于：利用杂交瘤细胞株制备，具体步骤如下：1.1饲养细胞的制备：取6-10周龄Balb/c小鼠，拉颈处死，浸泡于酒精内，消毒3-5min；转入无菌操作台中，用无菌剪刀剪开皮肤，使其腹膜充分暴露；用无菌注射器注入预冷的无血清1640培养液，用轻轻拍动小鼠腹腔，吸出培养液，放入离心管，离心；弃掉上清，用完全培养液重悬饲养细胞，计数，并调整细胞数至2×105个/mL，将饲养细胞加入96孔板中，每孔100μL，然后放入37℃的CO2培养箱培养；1.2杂交瘤细胞融合及有限稀释法亚克隆筛选a.制备免疫B细胞：将免疫后的小鼠摘眼球放血，收集血液后处死；无菌分离取出小鼠脾脏置于含有无血清1640培养液的平皿中，以无血清1640培养液润湿铜网，在培养皿中碾碎脾脏并以铜网过滤制备B细胞悬液，补充无血清培养液体积至40mL；将B细胞悬液离心，弃上清；重复以上步骤，再洗一次；b.制备骨髓瘤细胞：取培养与250mL培养瓶中的对数生长期骨髓瘤细胞SP2/0细胞1-2瓶，吹打细胞调整体积至40mL，转入50mL无菌离心管中，离心，弃上清，重复以上步骤，再洗一次；c.按照1/10—1/5的比例混合SP2/0骨髓瘤细胞与免疫B细胞，补加不完全1640培养液至40mL，1000r/min离心10min清洗一次；d.倾出上清液，吸净残留液体，轻弹管壁，使细胞疏松呈糊状；e.将含融合细胞的离心管置于37℃水浴，吸取0.8mL37℃预温的PEG4000，缓慢滴入管内，边加边旋转，60s内滴完，37℃静置90s以上；f.然后5min内加入10mL37℃预温的不完全培养基，第一分钟加1mL、第二分钟加1mL、第三分钟加1.5mL、第四分钟加1.5mL、第五分钟加完、最后补至30mL，于37℃静置5min，1000r/min离心6min；弃掉上清，缓慢加入20mL完全培养液，轻柔搅拌混匀后补足完全培养液至40mL，加入1×HAT培养基，分至4板已铺好饲养细胞的96孔板中，未加融合细胞的孔为阴性对照；g.5天后每孔补充50μL含1×HT培养基的完全培养液；h.当融合细胞，铺满1/4孔底时，不需换液，直接通过IELISA检测杂交瘤细胞抗体分泌情况；i.对得到的阳性孔进行复查和亚类鉴定，复查阳性并且亚类为IgG的细胞株用有限稀释法进行克隆化筛选，计数200个细胞以梯度铺板法铺于一块96孔板；j.根据后续ELISA检测结果，进行3-5次克隆化筛选，至所有有细胞的孔均为阳性，则得到单克隆杂交瘤细胞株，进行扩大培养；k.将抗体分泌阳性的克隆转入24孔板，进一步转种入培养瓶中扩大培养，冻存部分克隆细胞，同时进行克隆化培养；l.用IELISA方法对杂交瘤细胞培养上清进行交叉筛选；m.制备饲养细胞层100μL/孔，2×104个/孔，用无菌吸管吹打培养板中的克隆，悬浮于完全培养液，调整细胞浓度至10-20个/mL，加1×HT培养基，加入含饲养细胞的培养板中，100μL/孔，使每孔含有1-2个细胞，在培养箱中培养8-12天，当杂交瘤细胞铺满1/4孔底时，取上清检测；阳性孔再进行克隆化培养至100％克隆分泌特异性抗体为止，大量扩大培养，并标记好冻存于液氮罐中，记录冻存位置。2.根据权利要求1所述的哌拉西林单克隆抗体的制备方法，其特征在于：还包括哌拉西林单克隆抗体的纯化，步骤如下(1)柱子的预处理：a.将准备好的ProteinA/ProteinG填料取出转入50ml离心管中，加入适量乙醇，颠倒混匀，将填料混匀后转入空柱；b.将空柱灌满后，旋紧接头，将填料中的20％从接头端手动排出，至出口处保留1-2ml乙醇为止；c.将准备好的柱子接入AKTA系统，等待系统平衡及排除空气；(2)实验试剂配制：a.VBS缓冲液：pH7.2巴比妥缓冲液准确称量巴比妥0.737g，氯化钠8.766g，七水合硫酸镁0.197g，无水氯化钙0.033g，溶于1L蒸馏水中，用1MNaOH调节pH至7.2，于4℃保存；b.洗涤缓冲液—A液：10mMPBS，pH7.4；准确称量NaCl8g，十二水合磷酸氢二钠4.5g，磷酸二氢钾0.135g，氯化钾0.201g，溶于1L蒸馏水中，用1MHCl或1MNaOH调节pH至7.4±0.2；c.洗脱缓冲液—B液：0.1M甘氨酸盐酸，pH2.7；准确称量甘氨酸7.5g，溶于1L蒸馏水中，用1MHCl调节pH至2.7；d.中和缓冲液—C液：1MTris-HCl，pH9.0；准确称量Tris121.04g，溶于1L蒸馏水中，用1MHCl调节pH至9.0；e.20％乙醇准确量取无水乙醇200mL，与800mL蒸馏水混匀；(3)抗体纯化标准操作流程：a.取新鲜采集的腹水或冻存的腹水，倒入圆底高速离心管中，加入等体积的VBS稀释液，混匀；b.按照每10mL稀释腹水加入150mg二氧化硅粉末，混匀后，室温放置摇床200rpm孵育20-30min；c.离心，上清用0.45μm以下滤器过滤，补加至少1倍体积的10mMPBS，待用；d.打开Primeview软件，选择“...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵树铭，林裕翔，吴明磊，
申请(专利权)人：江苏中济万泰生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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