一种生物素化的insulin抗原及其生物素化工艺制造技术

本发明专利技术涉及酶联免疫技术领域，公开了一种生物素化的insulin抗原及其生物素化工艺。本发明专利技术通过改进的生物素化工艺对insulin抗原进行生物素化，获得式1所示结构的生物素化的insulin抗原，再经预先包被亲和素放大作用，大大提高了抗原insulin的包被效率，从而能显著提高以其制备的insulin抗体检测试剂或试剂盒的灵敏度，可大大提高insulin抗体检测的阳性率，减少漏检或误检的几率；

Biotinylated insulin antigen and biotinylated Technology

The invention relates to the field of enzyme-linked immunology technology, and discloses a biotinylated insulin antigen and a biotinylation process thereof. The insulin antigen is biotinylated by an improved biotinylation process, and the biotinylated insulin antigen with the structure shown in Eq. 1 is obtained. The encapsulation efficiency of the antigen insulin is greatly improved by pre-encapsulation of the biotinylated insulin antigen and amplification of the biotinylated insulin antigen by the pre-encapsulated avidin. Thus, the insulin antibody detection reagent or kit prepared by the Sensitivity can greatly increase the positive rate of insulin antibody detection and reduce the probability of missed detection or false detection.

【技术实现步骤摘要】
一种生物素化的insulin抗原及其生物素化工艺
本专利技术涉及酶联免疫
，具体涉及一种生物素化的insulin抗原及其生物素化工艺。
技术介绍
胰岛素(insulin)自身抗体的检测可作为自身免疫性β细胞损伤的标志，可用于早期发现和预防1型糖尿病，现在使用较广的是间接酶联免疫法，微孔板上包被胰岛素抗原，加待测血清，其中血清中的胰岛素自身抗体与微孔板上包被胰岛素抗原反应，洗涤，加酶标二抗，洗涤，加底物显色。生物素化是将生物素共价连接到蛋白质、核酸、或其他分子的过程。生物素能与亲和素或链霉亲和素结合，每个亲和素或链霉亲和素能结合四个分子生物素分子，且亲和力极强，亲和常数k＝1015L/mol，比抗原抗体间亲和力(K＝10.5-11L/mol)至少高100倍，两者结合特异性高，稳定性好。利用生物素-亲合素系统具有的特异性强和稳定性好的亲和作用，可将蛋白质生物素化后，再与亲和素/链霉亲和素特异性的结合，从而实现信号的放大、提高检测灵敏度的目的。目前市场上已有不少成熟的生物素化试剂，如thermo公司的Sulfo-NHS-LC-Biotin用于抗体、蛋白质的生物素化。但是，常规的insulin生物素化方法，如使用Sulfo-NHS-LC-Biotin生物素化试剂盒获得的insulin-生物素偶联物，用于开发的insulin抗体检测试剂盒存在灵敏度不足，阳性率低的缺点，存在漏检或误检等风险，均无法达到要求。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种生物素化的insulin抗原及其制备工艺，使得所述insulin抗原能够显著提高检测糖尿病胰岛素自身抗体(IAA)的阳性率；本专利技术的另外一个目的在于提供上述insulin抗原在制备酶联免疫试剂盒中的应用，特别是用于检测糖尿病的相关试剂盒；为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种生物素化的insulin抗原，具有式1所示结构：其中，圆形表示胰岛素氨基酸链，1≤x≤n，n表示胰岛素氨基酸链上氨基的数目，x和n均为整数；椭圆代表大分子蛋白氨基酸链，y+z≤m，z≥10，y≥1，m表示大分子蛋白氨基酸链上的氨基数目，y、z和m均为整数，若z/x为非整数，则z/x取整数且在整数位上加1。针对现有技术中insulin的生物素化效率不高，效果不好而导致的其用于开发insulin抗体检测的试剂或试剂盒灵敏度不足，阳性率偏低的问题，本专利技术通过改进的工艺将多个胰岛素分子通过SATA以及SMCC偶联到大分子蛋白氨基上，同时大分子蛋白偶联上生物素，形成的Biotin-大分子蛋白-insulin偶联物(式1结构)，结合多个insulin分子和生物素分子(示意图见图1)，再经预先包被亲和素放大作用，大大提高了抗原insulin的包被效率，从而能显著提高以其制备的insulin抗体检测试剂或试剂盒的灵敏度，可大大提高insulin抗体检测的阳性率，减少漏检或误检的几率。作为优选，所述大分子蛋白为HBA、BSA、OVA或酪蛋白；所述x优选为1。经过试验验证，采用常规方法获得的生物素化的insulin与本专利技术生物素化的insulin抗原，在用于检测时，本专利技术能够获得更高的IAA阳性率，避免样本因较低浓度而被漏检或错判。因此，本专利技术提出了所述生物素化的insulin抗原在制备酶联免疫试剂盒中的应用，特别是在制备糖尿病酶联免疫检测试剂盒中的应用。根据所述应用，本专利技术提供了一种糖尿病抗体谱检测试剂盒，包括包被有糖尿病自身抗原的蛋白芯片，所述糖尿病自身抗原通过亲和素化的蛋白芯片与生物素化的糖尿病自身抗原相互结合包被，所述生物素化的糖尿病自身抗原本专利技术所述insulin抗原。其中，亲和素优选为链霉亲和素。作为优选，所述试剂盒还包括酶联免疫吸附试剂盒其他常用组分，如酶标抗体、样品稀释液、洗涤液和显色液。本专利技术所述酶标抗体中酶标记物可选择常规的酶以及对应的显色液，如辣根过氧化物酶和TMB显色剂。作为优选，所述糖尿病自身抗原选自IA-2、GAD、IC、CPH、ZnT8、insulin中的一种或两种以上；在本专利技术具体实施方式中，所述糖尿病自身抗原为IA-2、GAD、IC、CPH、ZnT8和insulin。在包被中，所述糖尿病自身抗原采用CB缓冲液或Tris缓冲液为抗原稀释缓冲液进行包被；作为优选，所述缓冲液选自PH9.6的CB缓冲液或PH8.5的Tris缓冲液，更优选地，在缓冲液中添加PEG或者PVP，Proclin300，同时添加了水溶性的环糊精，可使包被更稳定、抗原包被点更规则、更圆，CV更小。其中，水溶性环糊精可以是Captisol、2-羟基-β-环糊精或羧甲基-β-环糊精等，浓度为0.02％；PEG或者PVP的浓度为5％，Proclin300浓度为0.05％，所述百分比中除Proclin300是体积百分比之外，其余都是质量百分比(w/v)。在本专利技术具体实施方式中，GAD和CPH的稀释缓冲液为PH8.5的0.02MTris缓冲液(含5％的PEG、0.05％的Proclin300，0.02％Captisol，以及15％的甘油)，终浓度分别为8ug/ml、30ug/ml。IA-2、IC、insulin、ZnT8的稀释缓冲液为PH9.6的CB缓冲液，终浓度分别为10ug/ml、10ug/ml、80ug/ml、15ug/ml。此外，本专利技术试剂盒中的蛋白芯片还包括阴性质控点、阳性质控点、样品质控点、酶标质控点、参考曲线点以及位置参考点中的一个或两个以上；更为具体地，至少有一个阴性质控点(NC)和一个阳性质控点(PC)；至少一个样品点质控点(SC)和一个酶标质控点(EC)；至少3个参考曲线点(S1-S3)以及一个芯片本身包被的位置参考点(Loc)。在具体实施方式中，本专利技术蛋白芯片上还包含一个阴性质控点(NC)和一个阳性质控点(PC)；一个样品点质控点(SC)和一个酶标质控点(EC)；3个参考曲线点(S1-S3)以及一个芯片本身包被的位置参考点(Loc)。其中，阳性质控点可以是人IgG，则对应使用的酶标抗体就是抗人IgG的酶标。阳性质控点也可以是包被BSA偶联的DNP，则对应使用的酶标抗体就是抗人IgG的酶标以及抗DNP的酶标的混合液。而阴性质控点可以是低于反应信号值的微量浓度的人IgG，或采用其他的无关蛋白来替代；样品质控点可以是羊抗人的IgG或其他的抗人IgG；酶标质控点可以是人IgG，或其他的抗兔的抗体(酶标用的是兔抗人IgG)，例如羊抗兔IgG抗体。所述参考曲线点在具体实施过程中是低、中、高三种浓度的人IgG。蛋白芯片本身的位置参考点是人IgG溶液，主要对蛋白芯片上阵列取值时的定位作用。优选地，上述阴性质控点、阳性质控点、样品质控点、酶标质控点、参考曲线点以及位置参考点也通过预先生物素化与亲和素化的底板包被。同时，本专利技术还提供了所述生物素化的insulin抗原的制备工艺，具体如下：步骤1、将insulin与S-乙酰硫基乙酸琥珀酰亚胺酯(SATA，购自Thermo)室温反应，透析纯化(副产物是小分子可以透过透析袋，大分子insulin-SH-P不能透过透析袋，通过多次透析的方式可以除去副产物)后获得insulin-SH-P，反应式如下：insulin-SH-P中，insulin表示胰岛素，SH表本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种生物素化的insulin抗原，其特征在于，具有式1所示结构：

【技术特征摘要】
1.一种生物素化的insulin抗原，其特征在于，具有式1所示结构：其中，圆形表示胰岛素，1≤x≤n，n表示胰岛素上氨基的数目，x和n均为整数；椭圆代表大分子蛋白，y+z≤m，z≥10，y≥1，m表示大分子蛋白上的氨基数目，y、z和m均为整数，若z/x为非整数，则z/x取整数且在整数位上加1。2.根据权利要求1所述insulin抗原，其特征在于，所述大分子蛋白为HBA、BSA、OVA或酪蛋白。3.权利要求1所述生物素化的insulin抗原在制备酶联免疫试剂盒中的应用。4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述酶联免疫试剂盒为糖尿病免疫检测试剂盒。5.权利要求1所述生物素化的insulin抗原的制备工艺，其特征在于，包括：步骤1、将insulin与S-乙酰硫基乙酸琥珀酰亚胺酯(SATA)室温反应，透析纯化后获得insulin-SH-P：n表示insulin上氨基数目，1≤x≤n，x和n均为整数；insulin-SH-P与盐酸羟胺的PBS室温反应去掉保护基团，经葡聚糖凝胶柱纯化后形成含活性巯基基团的insulin-SH，备用；大分子蛋白、Sulfo-N-琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸钠盐(SMCC)和琥珀酸亚酰胺-十二聚乙二醇-生物素室温反应，经过PBS透析纯化获得Biotin-大分子蛋白-SMCC；m表示大分子蛋白上的氨基数目，2≤y+z≤m，y、z...

【专利技术属性】
技术研发人员：张大准，张永顶，马伟民，王洪涛，马新民，
申请(专利权)人：深圳市伯劳特生物制品有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44