一种生物素化无机焦磷酸酶的表达方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种生物素化无机焦磷酸酶的表达方法，其中：使用一种由23个氨基酸残基组成的生物素受体蛋白BAP23，将BAP23的编码基因构建到大肠杆菌表达载体中后，获得重组表达载体，当无机焦磷酸酶编码基因插入到上述重组表达载体中后，表达的融合蛋白能够在大肠杆菌细胞内被生物素化修饰。按照本发明专利技术提供的表达方法表达的生物素化无机焦磷酸酶的产量达到21～38mg/100mL培养基；比活力达到94.2～151.6U/mg。表达的生物素化无机焦磷酸酶被磁珠固定后得到的Bead-LUC被反复洗涤3次后，催化活力几乎不受影响；被反复洗涤15次后，仍能够维持相较于洗涤前91％以上的相对活力。

【技术实现步骤摘要】
一种生物素化无机焦磷酸酶的表达方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种生物素化无机焦磷酸酶的表达方法。
技术介绍
无机焦磷酸酶(InorganicPyrophosphatase,PPase,EC3.6.1.1)是一类能够催化焦磷酸水解为正磷酸的酶。焦磷酸(Pyrophosphoricacid，PPi)是生物体内DNA和RNA聚合、氨基酸活化、氨酰tRNA合成、脂肪酸的β-氧化、脂酰辅酶A合成、纤维素合成、葡萄糖合成以及淀粉合成等过程的副产物，PPase通过分解PPi可使上述反应向合成方向进行并为多种生物合成反应提供能量。PPase广泛存在于自然界，在动物、植物和微生物中均有发现，并随着技术手段的发展，现已成功地从日本吸血虫、水稻、大麦、烟草、酵母、枯草芽胞杆菌、大肠杆菌以及嗜热细菌中获得了PPase的cDNA克隆。生物体内存在无机焦磷酸酶共分为四类：膜结合的无机焦磷酸酶(H+-PPase)和可溶性的家族I、II、III三类无机焦磷酸酶。根据其细胞定位与亚基结构，PPase在催化反应中，需要结合三或四个2价金属阳离子，例如二价镁离子(Mg2+)。PPase在体外具有增强DNA聚合酶的扩增效率以及增强RNA聚合酶在体外转录反应中的产量的功能。除此之外，PPase在焦磷酸测序等DNA测序技术中发挥重要作用。焦磷酸测序技术(Pyrosequencing)是利用生物发光反应进行序列测定的新一代测序技术。其基本原理为：在每一轮测序反应中，只加入四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)中的一种，若该dNTP能够与DNA模板的下一个碱基配对，则会在DNA聚合酶的催化下，将其掺入到测序引物链的3’末端，同时释放出一分子的PPi；在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi可以和5’-磷酰硫酸(Adenosine-5’-phosphosulfat，APS)结合形成等量的腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)；生成的ATP在荧光素酶的催化下，可以和荧光素结合形成氧化荧光素，同时产生可见光，通过微弱光检测装置及处理软件可获得一个特异的检测峰，峰值的高低则和相匹配的碱基数成正比；如果加入的dNTP不能和DNA模板的下一个碱基配对，则上述反应不会发生，也就没有检测峰；反应体系中剩余的dNTP和残留的少量ATP在三磷酸腺苷双磷酸酶(Apyrase)的作用下发生降解；待上一轮反应完成后，加入另一种dNTP，使上述反应重复进行，根据获得的峰值图即可读取准确的DNA序列信息。近年来出现了一种高通量光导纤维微反应池阵列焦磷酸测序技术，该技术一次可以测定上百万个样品，其出现带来了测序技术的革命，极大地推动了后基因组计划的发展。在上述高通量焦磷酸测序技术中，除了DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶以外，PPase是另一个重要用酶，其作用是通过清除多余的PPi来减少每一轮碱基加入期间反应仓微孔之间的交叉干扰，并且能够降低测序反应中的背景噪音。用于高通量焦磷酸测序技术的PPase需要被固定在微球表面，实现固定化的常用手段是将酶蛋白经过生物素标记后，通过与微球表面的链亲和素反应，从而被固定在微球表面。这就需要对PPase进行生物素化修饰。目前，通过化学手段能够实现蛋白质的生物素化修饰，其原理是通过化学反应将生物素连接到蛋白质中赖氨酸残基的游离氨基上。酶作为一种生物活性蛋白质，对有机试剂等因素非常敏感，然而在化学修饰过程中常常需要引入大量有机试剂，存在使酶活性降低甚至丧失的可能性；在化学修饰的过程中，如果处于蛋白质活性中心的赖氨酸残基被修饰，也很可能影响到酶蛋白质的催化活性；此外，化学修饰法还存在操作繁琐和产物不均一的缺点。因此，提供一种PPase的生物素化修饰方法，使其能够直接在细胞内被生物素修饰，能有效避免化学修饰法的缺陷或不良影响，同时增强其在焦磷酸测序技术中的实际应用性。
技术实现思路
除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本专利技术所属
的普通技术人员通常理解的相同意义。本专利技术中的术语“BAP23”指序列为SEQIDNO：1所示的氨基酸序列的生物素受体蛋白。本专利技术要解决的问题是提供一种生物素化无机焦磷酸酶的表达方法，以实现无机焦磷酸酶在宿主细胞内的生物素化修饰，为了解决上述技术问题，本专利技术的技术方案如下：一种生物素化无机焦磷酸酶的表达方法，其中：使用一种由23个氨基酸残基组成的生物素受体蛋白BAP23，将该生物素受体蛋白的编码基因构建到大肠杆菌表达载体中，获得一种携带上述生物素受体蛋白编码基因的重组表达载体，当无机焦磷酸酶的编码基因构建到上述重组表达载体中后，能够表达该生物素受体蛋白和无机焦磷酸酶的融合蛋白，该融合蛋白能够在大肠杆菌细胞内被生物素化修饰。其中，所述的生物素受体蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示：MAQRLFHILDAQKIEWHGPKGGS一种生物素化无机焦磷酸酶的表达方法，包括以下步骤：⑴.合成生物素受体蛋白BAP23的编码基因；⑵.将步骤⑴合成的生物素受体蛋白BAP23的编码基因构建到大肠杆菌表达载体中，获得重组表达载体A；⑶.将无机焦磷酸酶的编码基因构建到步骤⑵所得的重组表达载体A中，获得重组表达载体B；⑷.用步骤⑶所得的重组表达载体B转化大肠杆菌宿主细胞，获得重组基因工程菌A；⑸.以步骤⑷所得的重组基因工程菌A作为生产菌株，进行诱导表达培养。本专利技术所述的表达方法步骤⑴中所述的BAP23编码基因的核苷酸序列可以为SEQIDNO：2所示的序列。但根据本领域公共知识，密码子具有简并性，编码同一种氨基酸可以有几种不同的密码子，因此本专利技术所述的BAP23的编码基因序列并不局限于SEQIDNO：2所示的核苷酸序列。本专利技术所述的表达方法步骤⑵中的大肠杆菌表达载体为pMAL-p4E、pMAL-p4X、pMAL-p5E、pMAL-p5X、pET22b(+)、pET28a(+)、pET30a(+)和pET32a(+)中的任意一种；优选为pMAL-p4E、pMAL-p5E、pET28a(+)和pET30a(+)中的任意一种；进一步优选为pMAL-p4E和pET30a(+)中的任意一种；最优选为pET30a(+)。本专利技术所述的表达方法步骤⑶中所述的无机焦磷酸酶的编码基因可以通过PCR扩增或化学全合成的方式获得。本专利技术所述的表达方法步骤⑶中所述的无机焦磷酸酶的编码基因应当与BAP23的编码基因位于同一多克隆位点区。本专利技术所述的表达方法步骤⑶中所述的无机焦磷酸酶的编码基因可以构建到BAP23的编码基因的上游或下游；优选为上游。当本专利技术所述的表达方法步骤⑶中所述的无机焦磷酸酶的编码基因位于BAP23的编码基因上游时，应当去掉无机焦磷酸酶的编码基因的终止密码子。本专利技术所述的表达方法步骤⑷中所述的大肠杆菌宿主细胞可以为E.coliRosetta(DE3)。但根据本领域公共知识，功能基因连接到各类载体获得的重组载体，转入适当宿主细胞，在一定条件下均可实现目的蛋白的表达，因此本专利技术所述的大肠杆菌宿主细胞并不局限于E.coliRosetta(DE3)。本专利技术所述的表达方法步骤⑸中所述的诱导表达培养的方法为：挑取生产菌株单菌落接种于LB培养基，37℃培养24h，获得种子液；将上述种子液以1％(v/v)的接种量接种于TB培养基，37本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生物素化无机焦磷酸酶的表达方法，其特征在于：所述表达方法使用一种由23个氨基酸残基组成的生物素受体蛋白BAP23，将该生物素受体蛋白的编码基因构建到大肠杆菌表达载体中，获得一种携带上述生物素受体蛋白编码基因的重组表达载体，当无机焦磷酸酶的编码基因构建到上述重组表达载体中后，能够表达该生物素受体蛋白和无机焦磷酸酶的融合蛋白，该融合蛋白能够在大肠杆菌细胞内被生物素化修饰；其中，所述的生物素受体蛋白BAP23的序列为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种生物素化无机焦磷酸酶的表达方法，其特征在于：所述表达方法使用一种由23个氨基酸残基组成的生物素受体蛋白BAP23，将该生物素受体蛋白的编码基因构建到大肠杆菌表达载体中，获得一种携带上述生物素受体蛋白编码基因的重组表达载体，当无机焦磷酸酶的编码基因构建到上述重组表达载体中后，能够表达该生物素受体蛋白和无机焦磷酸酶的融合蛋白，该融合蛋白能够在大肠杆菌细胞内被生物素化修饰；其中，所述的生物素受体蛋白BAP23的序列为SEQIDNO：1所示的氨基酸序列。2.如权利要求1所述的表达方法，其特征在于：所述表达方法包括以下步骤：⑴.合成生物素受体蛋白BAP23的编码基因；⑵.将步骤⑴合成的生物素受体蛋白BAP23的编码基因构建到大肠杆菌表达载体中，获得重组表达载体A；⑶.将无机焦磷酸酶的编码基因构建到步骤⑵所得的重组表达载体A中，获得重组表达载体B；⑷.用步骤⑶所得的重组表达载体B转化大肠杆菌宿主细胞，获得重组基因工程菌A；⑸.以步骤⑷所得的重组基因工程菌A作为生产菌株，进行诱导表达培养。3.如权利要求2所述的表达方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：高静，蔡亦梅，吴超，徐潇，张睿，王者馥，王绪敏，殷金龙，任鲁风，
申请(专利权)人：北京中科紫鑫科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：北京;11