一种用于检测PDGFRA基因突变的引物组、试剂盒及方法技术

本发明专利技术涉及一种用于检测PDGFRA基因突变的引物组、试剂盒及方法，属于生物检测技术领域。本发明专利技术用于检测PDGFRA基因突变的引物组包括用于检测PDGFRA基因外显子12的PCR扩增引物对、用于检测PDGFRA基因外显子14的PCR扩增引物对和用于检测PDGFRA基因外显子18的PCR扩增引物对。本发明专利技术提供了一种新的用于检测PDGFRA基因突变的引物组，其可用于检测PDGFRA基因外显子12、外显子14和外显子18的突变情况；采用该引物组检测PDGFRA基因突变，特异性好、准确度高和灵敏度好，对低突变率的样本也能准确检出。

Primer group, reagent kit and method for detecting PDGFRA gene mutation

The invention relates to a primer group, a kit and a method for detecting PDGFRA gene mutation, belonging to the technical field of biological detection. The primer group for detecting PDGFRA gene mutation includes PCR amplification primers for detecting PDGFRA exon 12, PCR amplification primers for detecting exon 14 of PDGFRA gene, and PCR amplification primers for detection of exon 18 of PDGFRA gene. The invention provides a new primer group for detecting the mutation of PDGFRA gene, which can be used to detect the mutation of exon 12, exon 14 and exon 18 of PDGFRA gene; the primer group is used to detect the mutation of PDGFRA gene, with good specificity, high accuracy and sensitivity, and can be accurately detected for the samples with low mutation rates.

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测PDGFRA基因突变的引物组、试剂盒及方法
本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种用于检测PDGFRA基因突变的引物组、试剂盒及方法。
技术介绍
PDGFRA基因(血小板源性生长因子)位于人类染色体4q11-q12，属于第Ⅲ类酪氨酸激酶受体。研究表明，PDGFR通路的激活也涉及关键的下游信号通路，包括RAS-MAPK途径/PI3K途径。胃肠间质瘤(GIST)是较常见的消化道间叶性肿瘤，研究表明，在GIST中PDGFRA基因突变率为5％，PDGFRA突变主要发生在编码活性结构域的18外显子，其次为编码近膜域的12外显子，发生在14外显子的突变极少(<1％)。目前对PDGFRA基因突变的检测方法主要包括测序法、ARMS和RT-PCR等。ARMS技术是目前国内应用最为广泛的技术，但对样本量要求高；RT-PCR技术成本较低，但检测率较高，容易出现假阳性结果；Sanger测序法是DNA序列分析的经典方法，被认为是检测基因突变的金标准，具有技术和平台成熟、结果准确和全面等优点。但是其检测灵敏度约为15-20％，即突变基因含量要大于15％甚至20％才能被可靠检出。而胃肠间质瘤患者PDGFRA基因突变率较低，现有的Sanger测序法很难将其检测出来。因此，急需提供一种灵敏度高、特异性好的PDGFRA基因突变检测产品和方法，在保证特异性和准确率的同时具有很好的灵敏度，能将低突变率的样本中的PDGFRA基因突变准确检出。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种特异性好、准确度高和灵敏度高的用于检测PDGFRA基因突变的引物组及方法。与此相应，本专利技术还提供了含有上述引物组的试剂盒以及上述引物组在制备用于检测PDGFRA基因突变的试剂盒中的应用。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：一种用于检测PDGFRA基因突变的引物组，其包括用于检测PDGFRA基因外显子12的PCR扩增引物对、用于检测PDGFRA基因外显子14的PCR扩增引物对和用于检测PDGFRA基因外显子18的PCR扩增引物对；其中，所述用于检测PDGFRA基因外显子12的PCR扩增引物对包括如SEQIDNO:1所示的上游引物和如SEQIDNO:2所示的下游引物；所述用于检测PDGFRA基因外显子14的PCR扩增引物对包括如SEQIDNO:3所示的上游引物和如SEQIDNO:4所示的下游引物；所述用于检测PDGFRA基因外显子18的PCR扩增引物对包括如SEQIDNO:5所示的上游引物和如SEQIDNO:6所示的下游引物。本专利技术提供的上述引物组，可用于检测PDGFRA基因外显子12、外显子14和外显子18的突变情况；采用该引物组检测PDGFRA基因突变，特异性好、准确度高。作为本专利技术所述用于检测PDGFRA基因突变的引物组的优选实施方式，所述用于检测PDGFRA基因外显子12的PCR扩增引物对还包括如SEQIDNO:7和SEQIDNO:8所示的巢氏引物；所述用于检测PDGFRA基因外显子14的PCR扩增引物对还包括如SEQIDNO:9和SEQIDNO:10所示的巢氏引物；所述用于检测PDGFRA基因外显子18的PCR扩增引物对还包括如SEQIDNO:11和SEQIDNO:12所示的巢氏引物。因福尔马林固定、石蜡包埋切片组织(FFPE)在固定过程中会造成组织成分的广泛交联，导致DNA被修饰、降解以及断裂等，造成所提取的DNA质量较差，采用所述巢氏引物，能进一步增强检测c-kit基因突变的检出率与准确性。作为本专利技术所述用于检测PDGFRA基因突变的引物组的优选实施方式，所述引物组还包括如SEQIDNO:13和SEQIDNO:14所示的测序引物。另外，本专利技术还提供了一种用于检测PDGFRA基因突变的试剂盒，所述试剂盒包括上述用于检测PDGFRA基因突变的引物组。本专利技术的试剂盒，由于其含有特定的PCR扩增引物，将其用来检测PDGFRA基因突变时，特异性好、准确度高和灵敏度高，对低突变率的样本也能准确检出，可完全满足检测的需要。本专利技术所述的PDGFRA基因突变率定义为样本中突变型PDGFRA基因占总PDGFRA基因(野生型和突变型PDGFRA基因的总和)的比例。作为本专利技术所述用于检测PDGFRA基因突变的试剂盒的优选实施方式，所述试剂盒还包括DNA提取试剂、DNA聚合酶、缓冲溶液和琼脂糖凝胶。其中，DNA提取试剂可通过购买DNA提取试剂盒得到，例如，FFPE组织DNA提取试剂盒。再者，本专利技术还提供了上述引物组在制备用于检测PDGFRA基因突变的试剂盒中的应用。最后，本专利技术还提供了一种用于非疾病的诊断和治疗的PDGFRA基因突变的检测方法，其包括以下步骤：(1)提取待测样品中的DNA；(2)以步骤(1)提取的DNA为模板，以上述引物组为引物进行PCR扩增；(3)采用电泳分析步骤(2)PCR扩增的产物，并对产物进行回收；(4)用测序引物进行Sanger测序，并分析测序结果。作为本专利技术所述检测方法的优选实施方式，所述步骤(1)采用FFPE组织DNA提取试剂盒提取待测样品中的DNA。与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：(1)本专利技术提供了一种新的用于检测PDGFRA基因突变的引物组，其可用于检测PDGFRA基因外显子12、外显子14和外显子18的突变情况；本专利技术提供的引物组是专利技术人经过大量的实验和探索得来的，检测PDGFRA基因突变特异性好、准确度高，同时能大大提高检测的灵敏度，使低突变率的样本也能准确检出，避免出现假阴性结果；(2)本专利技术提供的引物组具有很好的特异性，制备得到的测序模板中无任何非特异性条带，可直接用于后续的测序，不需要对测序模板进行纯化处理，简化了实验步骤。附图说明图1为PDGFRA基因外显子12、14和18扩增的电泳分析结果图；图2为PDGFRA基因外显子12部分扩增序列的Sanger测序图；图3为PDGFRA基因外显子14部分扩增序列的Sanger测序图；图4为PDGFRA基因外显子18部分扩增序列的Sanger测序图。具体实施方式为更好的说明本专利技术的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例和附图对本专利技术作进一步说明。下述实施例中，所用到试剂的来源为：DNA聚合酶(包含缓冲液、MgCl2)，商品名：Q5TM热启动超保真2×MasterMix(货号：M0494L)，生产商：NEB，贮存条件：-15～-25℃；琼脂糖，商品名：REGULARAGAROSEG-10(货号:111935)，生产商：Biowest，储存条件：室温；SizeStandards，商品名：MarkI/II(货号：MD101-02/MD102-02)，生产商：TIANGEN，贮存条件：长期储存于-15～-25℃保存；工作液于2～8℃保存。下述实施例中，所用到的设备如下表1所示：表1仪器设备实施例1本专利技术用于检测PDGFRA基因突变的引物组的一种实施例，本实施例所述用于检测PDGFRA基因突变的引物组如表2所示。表2引物序列注：引物中有A代表nest-PCR第一轮扩增引物，有B代表nest-PCR中的巢氏引物。采用表1的引物能够特异地扩增相应的外显子片段。进一步地，本实施例所述用于检测PDGFRA基因突变的引物组还包括下述测序引物：本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测PDGFRA基因突变的引物组，其特征在于：包括用于检测PDGFRA基因外显子12的PCR扩增引物对、用于检测PDGFRA基因外显子14的PCR扩增引物对和用于检测PDGFRA基因外显子18的PCR扩增引物对；其中，所述用于检测PDGFRA基因外显子12的PCR扩增引物对包括如SEQ ID NO:1所示的上游引物和如SEQ ID NO:2所示的下游引物；所述用于检测PDGFRA基因外显子14的PCR扩增引物对包括如SEQ ID NO:3所示的上游引物和如SEQ ID NO:4所示的下游引物；所述用于检测PDGFRA基因外显子18的PCR扩增引物对包括如SEQ ID NO:5所示的上游引物和如SEQ ID NO:6所示的下游引物。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测PDGFRA基因突变的引物组，其特征在于：包括用于检测PDGFRA基因外显子12的PCR扩增引物对、用于检测PDGFRA基因外显子14的PCR扩增引物对和用于检测PDGFRA基因外显子18的PCR扩增引物对；其中，所述用于检测PDGFRA基因外显子12的PCR扩增引物对包括如SEQIDNO:1所示的上游引物和如SEQIDNO:2所示的下游引物；所述用于检测PDGFRA基因外显子14的PCR扩增引物对包括如SEQIDNO:3所示的上游引物和如SEQIDNO:4所示的下游引物；所述用于检测PDGFRA基因外显子18的PCR扩增引物对包括如SEQIDNO:5所示的上游引物和如SEQIDNO:6所示的下游引物。2.如权利要求1所述的用于检测PDGFRA基因突变的引物组，其特征在于：所述用于检测PDGFRA基因外显子12的PCR扩增引物对还包括如SEQIDNO:7和SEQIDNO:8所示的巢氏引物；所述用于检测PDGFRA基因外显子14的PCR扩增引物对还包括如SEQIDNO:9和SEQIDNO:10所示的巢氏引物；所述用于检测PDGFRA基因外显子18的PCR扩增引物对还包括如SEQIDNO:11...

【专利技术属性】
技术研发人员：于世辉，胡昌明，黄晓强，周丹燕，毛琳琳，徐艳艳，海洋，周杏子，刘晶星，赵薇薇，赵强，袁海明，陈白雪，喻长顺，
申请(专利权)人：广州金域医学检验集团股份有限公司，广州金域医学检验中心有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44