一种发酵制备达托霉素的方法技术

本发明专利技术提供了一种发酵制备达托霉素的方法。具体而言，本发明专利技术提供了一种发酵制备达托霉素的方法，该方法采用在发酵培养期间以不同的速率流加癸酸前体化合物以及碳源的操作方式，显著提高了达托霉素的发酵效价。

A method of fermentation for the preparation of dotomycin

The invention provides a method for preparing damomycin by fermentation. In particular, the invention provides a method of fermentation for the preparation of trecomycin. The method uses different rate flow with different rate flow and the operation mode of carbon source compound and carbon source during the fermentation period, which significantly improves the fermenting titer of trecomycin.

【技术实现步骤摘要】
一种发酵制备达托霉素的方法
本专利技术属于发酵
，涉及一种微生物发酵制备达托霉素的方法。
技术介绍
达托霉素(Daptomycin)是一种从玫瑰孢链霉菌(Streptomycesroseosporus)发酵液分离得到的环脂肽类抗生素，其化学结构如式(I)所示。从式(I)可以看出，达托霉素由13个氨基酸和1个长链脂肪酸组成，其中10个氨基酸组成一个氨基酸环，另有3个氨基酸排列成线状，并且在末端的L-色氨酸(L-Trp)上，连接1个正癸酸。通常情况下，达托霉素为黄色或淡黄色晶体物质，能溶于水、甲醇、乙醇、丙醇、正丁醇、二甲基甲酰胺、二氯杂环乙烷、四氢呋喃和二甲基亚砜，微溶或不溶于丙酮、氯仿、乙醚、苯和乙酸乙酯。近10年来，革兰氏阳性耐药菌感染的趋势在不断上升。目前临床上治疗细菌感染的难点主要集中于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)，耐万古霉素的肠球菌(VRE)，糖肽类敏感的金葡菌(GISA)等，它们也是目前医院中传播率致死率很高的病原体，虽然万古霉素等糖肽类抗生素治疗这类感染取得了一定疗效，但近几年来，临床上已发现万古霉素的耐药菌，而且这种趋势在逐渐增大。因此抗耐药菌新抗生素的研究又成为热门课题。达托霉素对以上耐药菌均有很好的杀菌效果，且制剂用药方便，毒副作用小，成为“病原菌最后一道防线—万古霉素”的最佳替代品；更具意义的是，达托霉素不仅具有新颖的化学结构，其作用模式也与任何现有上市的抗生素不同：达托霉素能扰乱细胞膜对氨基酸的转运，从而阻碍细菌细胞壁肽聚糖的生物合成，改变细胞质膜的性质；另外，它还能通过破坏细菌的细胞膜，使其内容物外泄而达到杀菌的目的。达托霉素通过从多个方面破坏细菌细胞膜功能，能迅速杀死革兰氏阳性菌，并且使细菌很难对其产生耐药性(A.Rajaetal.,NatureRev.DrugDiscov.,2003,2,943-944)。达托霉素除了能作用于大多数临床相关革兰氏阳性菌外，更重要的是，它在体外试验中还对甲氧西林、万古霉素和利奈唑烷等的耐药分离菌株呈现出强力的活性。达托霉素的合成方法有化学全合成、化学半合成和生物合成三种工艺，其中前二种由于工艺过程复杂且产率低尚无商业价值。目前，行业内生产达托霉素的常规方法主要是通过玫瑰孢链霉菌菌株发酵制得。发酵法合成达托霉素时，首先通过玫瑰孢链霉菌生成达托霉素的母核化合物A21978C，然后向发酵液中补加前体癸酸提供侧链，通过生物酰化作用合成终产品，癸酸的前体化合物包括癸酸、癸酸盐、癸酸酯、癸醛等，前体的添加方式是制约达托霉素的生物合成的步骤。CN102242073A中公开的发酵方法采用流加癸酸，间歇补料的方法进行发酵产物的调控，但是癸酸单独补加时，由于其本身的性质，在发酵温度下易凝固。期刊《化学与生物工程》，2014，Vol.31，No.08《达托霉素发酵培养基配方及30L罐工艺优化》中公开，在达托霉素的发酵过程中，采用特定培养基，癸酸钠流加补料，补料时间为发酵开始28h，且补料总量为1.5％时，最终发酵效价明显提高。《中国医药工业杂志》2013,44(9)《达托霉素的菌种选育及补料发酵工艺》公开：在5L小罐中培养48h后,以2.0ml·(h·L)-1的速度流加癸酸-油酸甲酯(1:1)，达托霉素产量提高到1680mg/L，在工业上，发酵存在的不确定因素很多，该方法能否在放大时保持稳定，不得而知。US8313922B公开了在癸醛或者萼距花植物油存在的条件下发酵达托霉素的方法，其中上述癸酸或者萼距花植物油提供了正癸酰基的来源；BioprocessBiosystEng(2014)37:415-423中公开一种达托霉素的发酵方法，在发酵进行24h后，流加2％(w/v)的癸酸钠，当碳源的浓度小于20g/L时，补加葡聚糖用量增加达托霉素的产量；CN101880703A公开了流加癸酸盐发酵达托霉素的方法；CN102796680A公开了以CGMCCNo.5956为达托霉素的发酵菌种，发酵过程中向发酵液中补加癸酸和癸醛组成的组合物前体合成达托霉素的方法；CN101824452A公开的方法中，在发酵30h后以0.10mL/h的速度流加癸酸-油酸甲酯(1:1)溶液，在96h流加甘油作为菌体后期的主要碳源，从而延长达托霉素合成时间；CN103695509A中公开的方法，在发酵培养18h后以1.0～2.0mL/h的流速补加癸醛溶液，提高达托霉素的产量，虽然已经有上述诸多的文献及专利涉及到癸酸前体的添加方法，但是工业上仍然需要在大规模发酵时稳定、高产的达托霉素的生产方法。
技术实现思路
本专利技术提供一种发酵制备达托霉素的方法，该方法在整个发酵过程中均流加碳源，发酵至18～30h时，开始以第一速率流加癸酸前体化合物；发酵至28～40h时，癸酸前体化合物的流加由第一速率切换至第二速率直至发酵结束。本专利技术中，在发酵至18～30h时，对发酵液的生物量进行监测，当生物量在20％～25％之间时，即可开始以第一速率流加癸酸前体化合物，在开始流加癸酸前体化合物10～12h之后，对发酵液的溶氧值及生物量进行监测，若溶氧值无明显升高，生物量依旧维持在20％～25％的范围内，则癸酸前体化合物的流加速率切换至第二速率。本专利技术提供的方法中所述的癸酸前体化合物选自癸酸或癸酸盐，癸酸盐选自癸酸钠、癸酸钾、癸酸铵，优选癸酸或癸酸钠。本专利技术提供的方法，当癸酸前体化合物为癸酸时，其与耦合剂耦合，所述耦合剂选自油酸甲酯、乙醇、氨水，优选油酸甲酯。本专利技术提供的方法中癸酸与耦合剂的比例为1:0.5～2.5，优选1:1。本专利技术提供的方法，当癸酸前体化合物选癸酸盐时，癸酸盐以溶液形式流加，癸酸盐溶液的浓度为5％～15％(w/v)，优选8％～12％(w/v)，最优选10％(w/v)。本专利技术提供的方法，当癸酸前体化合物为癸酸时，流加的第一速率为0.05～0.20mL/L/h，优选0.10～0.14mL/L/h，最优选0.12mL/L/h；第二速率为0.15～0.30mL/L/h，优选0.22～0.26mL/L/h，最优选0.24mL/L/h。本专利技术提供的方法，当癸酸前体化合物为癸酸盐时，流加的第一速率为0.01～0.15g/L/h，优选0.03～0.10g/L/h，最优选0.06g/L/h；第二速率为0.05～0.20mL/L/h，优选0.10～0.14mL/L/h，最优选0.12g/L/h。本专利技术提供的方法中所述的碳源选自葡萄糖、乳糖、糖蜜、麦芽糊精、淀粉、山梨醇的一种或几种，优选葡萄糖。本专利技术提供的方法中碳源的浓度为30％～70％(w/v)，优选40％～60％(w/v)，优选50％(w/v)。本专利技术提供的方法中碳源的流加速率分第一速率与第二速率，其中第一速率为0.20～0.45mL/L/h，优选0.30～0.38mL/L/h，最优选0.34mL/L/h。本专利技术提供的方法自发酵开始23～35h后，碳源的流加速率调至第二速率直至发酵结束，第二速率为0.30～0.60mL/L/h，优选0.39～0.47mL/L/h，最优选0.43mL/L/h。本专利技术提供的达托霉素的制备方法还包括无菌接种菌种于一级种子培养基中，培养得到一级种子液；将一级种子液接种至二级种子培养基，培养得到二级种子液，将二级种子液接种至发酵培养基中进行本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种发酵法制备达托霉素的方法，其特征在于整个发酵过程中流加碳源，发酵至18～30h时，开始以第一速率流加癸酸前体化合物，发酵至28～40h时，将癸酸前体化合物的流速调节至第二速率，直至发酵结束。

【技术特征摘要】
2017.01.22 CN 20171005292351.一种发酵法制备达托霉素的方法，其特征在于整个发酵过程中流加碳源，发酵至18～30h时，开始以第一速率流加癸酸前体化合物，发酵至28～40h时，将癸酸前体化合物的流速调节至第二速率，直至发酵结束。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的癸酸前体化合物选自癸酸、癸酸盐，其中癸酸盐选自癸酸钠、癸酸钾、癸酸铵，优选癸酸或癸酸钠。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的癸酸与耦合剂耦合，所述耦合剂选自油酸甲酯、乙醇、氨水，优选油酸甲酯。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述癸酸与耦合剂的比例为1:0.5～2.5，优选1:1。5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的癸酸盐以溶液形式流加，癸酸盐溶液浓度为5％～15％w/v，优选8％～12％w/v，最优选10％w/v。6.据权利要求4所述的方法，其特征在于所述癸酸-耦合剂的第一速率为0.05～0.20mL/L/h，优选0.10～0.14mL/L/h，最优选0.12mL/L/h，所述癸酸-耦合剂的第二速率为0.15～0.30mL/L/h，优选0.22～0.26mL/L/h，最优选0.24mL/L/h。7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述癸酸盐溶液的第一速率为0.01～0.15g/L/h，优选0.03～0.10g/L/h，最优选0.06g/L/h；所述癸酸盐溶液第二速率为0.05～0.20mL/L/h，优选0.10～0.14mL/L/h，最优选0.12g/L/h。8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述碳源选自葡萄糖、乳糖、糖蜜、麦芽糊精、淀粉、山梨醇的一种或几种，优选葡萄糖。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述碳源的浓度为30％～70％w/v，优选40％～60％w/v，优选50％w/v。10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述碳源的流加速率分第一速率与第二速率，其中第一速率为0.20～0.45mL/L/h，优选0...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔亚顺，任宏杰，王宏伟，张云辉，
申请(专利权)人：江苏恒瑞医药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32