一种生产重组水蛭素的方法技术

本发明专利技术公开了一种生产重组水蛭素的方法，所述方法包括：将pBH‑2工程菌(保藏号：CGMCC No.0908)接种至包含碳源物质和氮源物质的发酵培养基中，首先在25℃‑35℃的温度下培养至对数生长期结束，然后升温至35℃‑45℃继续进行培养，该升温过程是在1小时内完成，可选地在10分钟内完成，还可选地在5分钟内完成。

【技术实现步骤摘要】
一种生产重组水蛭素的方法
本专利技术涉及生物工程技术，特别是发酵工程，尤指一种生产重组水蛭素的方法。
技术介绍
水蛭素是凝血酶特异性抑制剂，能有效预防和治疗弥散性血管内凝血，在心脑血栓疾病方面均有显著作用。由于天然的水蛭素产量有限，每条水蛭只含20μg的水蛭素，不能满足临床应用的要求，为此，采用生物工程技术生产重组水蛭素的研究——特别是能够生产高产率的重组水蛭素的方法——显得尤为重要。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种生产重组水蛭素的方法，所述方法采用pBH-2工程菌(大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)；中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2003年03月19日；保藏编号：CGMCCNo.0908)，通过高密度、高表达的发酵工艺生产重组水蛭素，能够极大地提高重组水蛭素的产量。为了达到本专利技术目的，本专利技术提供了一种生产重组水蛭素的方法，所述方法包括：将pBH-2工程菌(保藏号：CGMCCNo.0908)接种至包含碳源物质和氮源物质的发酵培养基中，在需氧条件下，在25℃-35℃的温度下培养至对数生长期结束，然后升温至35℃-45℃继续进行培养至水蛭素产量达到峰值。在以上或其他实施方式中，可以继续培养3-16小时或更长，使得水蛭素产量达到峰值。在以上或其他实施方式中，可以在30℃的温度下培养至对数生长期结束。在以上或其他实施方式中，可以升温至42℃继续进行培养3-16小时或更长，使得水蛭素产量达到峰值。在以上或其他实施方式中，升温过程可以在1小时内完成。在以上或其他实施方式中，升温过程可以在10分钟内完成。在以上或其他实施方式中，升温过程可以在5分钟内容完成。在以上或其他实施方式中，所述碳源物质可以选自葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉、糊精、乳糖、果糖和甘油中的一种或更多种。其中，所述发酵培养基中的所述碳源物质的加入量可以由本领域技术人员根据需要确定。例如，在一些情况下，所述发酵培养基中的所述碳源物质的量为基于培养基溶液的总体积计的5-200g/L。在以上或其他实施方式中，所述碳源物质可以为蔗糖。在以上或其他实施方式中，所述碳源物质可以为蔗糖与选自葡萄糖、麦芽糖、淀粉、糊精、乳糖、果糖和甘油中的一种或更多种的组合。在以上或其他实施方式中，其中所述氮源物质可以选自玉米浆、酵母粉、蛋白胨、牛肉浸膏、酵母提取物、硝酸铵、氯化铵和硫酸铵中的一种或更多种。所述发酵培养基中的所述氮源物质的加入量可以由本领域技术人员根据需要确定。例如，在一些情况下，所述发酵培养基中的所述氮源物质的量为基于培养基溶液的总体积计的10-120g/L。在以上或其他实施方式中，所述氮源物质可以为酵母粉、蛋白胨或酵母粉和蛋白胨两者。在以上或其他实施方式中，所述氮源物质可以为酵母粉、蛋白胨或酵母粉和蛋白胨两者与选自玉米浆、牛肉浸膏、酵母提取物、硝酸铵、氯化铵和硫酸铵中的一种或更多种的组合。在以上或其他实施方式中，所述氮源可以选自安琪蛋白胨FP318、安琪酵母粉FM818或两者。在以上或其他实施方式中，其中所述发酵培养基中的所述碳源物质与所述氮源物质的重量比可以为0.2-40：1。在以上或其他实施方式中，其中所述发酵培养基中的所述碳源物质与所述氮源物质的重量比可以为1.1:1。在以上或其他实施方式中，还可以向所述培养基中加入其它无机物质以促进微生物的生长和提高重组水蛭素的产率。比如，在以上或其他实施方式中，所述发酵培养基还可以包含磷酸盐、镁盐、钠盐或其组合，可选地，所述磷酸盐选自磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠和磷酸氢二钠中的一种或更多种。在以上或其他实施方式中，所述磷酸盐的加入量可以为基于培养基溶液的总体积计的0.2-20g/L。在以上或其他实施方式中，所述镁盐可以为硫酸镁或氯化镁。在以上或其他实施方式中，所述镁盐的加入量可以为基于培养基溶液的总体积计的0.1-1.5g/L。在以上或其他实施方式中，所述钠盐可以选自氯化钠、柠檬酸钠、硫酸钠、醋酸钠中的一种或更多种。在以上或其他实施方式中，所述钠盐的加入量可以为基于培养基溶液的总体积计的0.1-25g/L。本申请的专利技术人发现，钠盐的加入有利于促进pBH-2工程菌表达更多的重组水蛭素。在以上或其他实施方式中，所述培养基还可以包含铁盐、锰盐、铝盐、钴盐、锌盐、铜盐、镍盐、硼酸、维生素B1中的一种或更多种。本领域技术人员可以根据实际需要选择上述各个组分并确定其添加量。在以上或其他实施方式中，所述发酵培养基还可以含有抗生素物质。在以上或其他实施方式中，所述抗生素物质可以为氨苄青霉素(AMP)。在以上或其他实施方式中，所述抗生素物质的加入量为基于培养基溶液的总体积计的0.01-0.2g/L。在以上或其他实施方式中，所述抗生素物质可以分两次加入发酵培养基中，其中第一次加入是在接种时且第二次加入是在菌体培养至对数生长期结束之前。在以上或其他实施方式中，第一次在接种时以培养基溶液的总体积计的0.01-0.2g/L的量加入所述抗生素物质，第二次在菌体培养至对数生长期结束之前，以基于培养基溶液的总体积计的0.01-0.2g/L的量加入抗生素物质。在以上或其他实施方式中，所述抗生素物质的第二次加入可以以流的形式进行添加。本申请的专利技术人经过大量的实验研究发现，在第二次加入抗生素物质比如氨苄青霉素AMP时，把抗生素物质的流加进发酵液较一次性加入更有利于促进pBH-2工程菌表达更多的重组水蛭素。例如，流加的方式可以为将流速控制在每分钟补入基于培养基溶液的总体积计的0.017mg/L-0.33mg/L的抗生素物质。在以上或其他实施方式中，所述发酵培养基的组成物质比如氮源物质和碳源物质及其他可选择加入的物质可以分两次加入，其中第一次加入是在接种前加入，第二次加入是于接种后以流的方式加入且在13小时内完成。在以上或其他实施方式中，可以以1％-20％的接种量将所述pBH-2工程菌接种至所述发酵培养基。在以上或其他实施方式中，可以以15％的接种量将所述pBH-2工程菌接种至所述发酵培养基。在以上或其他实施方式中，菌株培养初始pH值为5.5-11，其中，初始pH值为培养基配制完毕后，用0.5N-1N的氢氧化钠来调节。在以上或其他实施方式中，菌株培养初始pH值为6.5-8.0，可选地为7.0。在以上或其他实施方式中，在培养过程用0.5N-1N的HCl和0.5N-1N的NaOH或10wt％-20wt％氨水将pH值调整为4-9.5，可选6.5-8.0。在以上或其他实施方式中，本申请的菌株培养是在需氧条件下进行的。在以上或其他实施方式中，在本申请的菌株培养过程中，控制溶氧值达40％以上。在以上或其他实施方案中，在本申请的菌株培养过程中，通过在摇瓶上使用装量10-20ml/100ml，转速250-300rpm，在发酵罐上接种后使用较大通气量(例如控制溶氧值达40％以上)，通过调节转速、通气量和通氧气等手段达到调控目的。在以上或其他实施方式中，所述方法还包括对菌株发酵液进行灭活处理，灭活温度60℃-80℃，可选75℃；灭活时间为5min-20min。在以上或其他实施方式中，所述方法还包括：灭活处理后的菌株发酵液经0.1～1μm孔径的陶瓷膜进行固液分本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种生产重组水蛭素的方法，其特征在于，包括：将pBH‑2工程菌(保藏号：CGMCC No0908)接种至包含碳源物质和氮源物质的发酵培养基中，在需氧条件下，在25℃‑35℃的温度下培养至对数生长期结束，然后升温至35℃‑45℃继续进行培养至水蛭素产量达到峰值；可选地继续培养3‑16小时或更长，使得水蛭素产量达到峰值；可选地在30℃的温度下培养至对数生长期结束，可选地升温至42℃继续进行培养3‑16小时或更长。

【技术特征摘要】
1.一种生产重组水蛭素的方法，其特征在于，包括：将pBH-2工程菌(保藏号：CGMCCNo0908)接种至包含碳源物质和氮源物质的发酵培养基中，在需氧条件下，在25℃-35℃的温度下培养至对数生长期结束，然后升温至35℃-45℃继续进行培养至水蛭素产量达到峰值；可选地继续培养3-16小时或更长，使得水蛭素产量达到峰值；可选地在30℃的温度下培养至对数生长期结束，可选地升温至42℃继续进行培养3-16小时或更长。2.根据权利要求1所述的方法，其中升温过程是在1小时内完成，可选地在10分钟内完成，还可选地在5分钟内完成。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述碳源物质选自葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉、糊精、乳糖、果糖和甘油中的一种或更多种，可选地，所述碳源物质为蔗糖，或所述碳源物质为蔗糖与选自葡萄糖、麦芽糖、淀粉、糊精、乳糖、果糖和甘油中的一种或更多种的组合。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述氮源物质选自玉米浆、酵母粉、蛋白胨、牛肉浸膏、酵母提取物、硝酸铵、氯化铵和硫酸铵中的一种或更多种，可选地，所述氮源物质为酵母粉、蛋白胨或酵母粉和蛋白胨两者，或所述氮源物质为酵母粉、蛋白胨或酵母粉和蛋白胨两者与选自玉米浆、牛肉浸膏、酵母提取物、硝酸铵、氯化铵和硫酸铵中的一种或更多种的组合。5.根据权利要求1所述的方法，其中所述发酵培养基中的所述碳源物质与所述氮源物质的重量比为0.2-40：1，可选地为1.1:1。6.根据权利要求1所述的方法，其中所述发酵培养基还包含磷酸盐、镁盐、钠盐或其组合，可选地，所述磷酸盐选自磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠和磷酸氢二钠中的一种或更多种；可选地，所述镁盐为硫酸镁或氯化镁；...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈杰鹏，段丽丽，洪琳，陈煜藩，陈鸿锐，邱雪莲，蔡桂珠，胡留松，许志锴，叶红林，黄晓莹，纪烨瑜，
申请(专利权)人：广东双骏生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44