控制蛋白酶产生的方法技术

本发明专利技术涉及蛋白质生产领域。其介绍了具有低蛋白酶活性的新宿主细胞、新蛋白酶调节剂、其在表达系统和蛋白质生产中的用途和产生用于蛋白质生产的宿主细胞的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】控制蛋白酶产生的方法专利
本专利技术涉及蛋白质生产领域。更具体地，其公开了新的蛋白酶表达调节剂和其在宿主细胞中生产目标蛋白的用途。
技术介绍
微生物，例如真菌和丝状真菌，被广泛用作宿主细胞以表达和细胞外分泌目标蛋白，例如重组蛋白。微生物当用作宿主细胞时经常面临的一个缺点是它们固有产生和分泌蛋白水解酶，其降解目标蛋白。当产生敏感的、不稳定的或兼而有之的目标蛋白时，这一问题是特别困难的。因此，宿主细胞的内源蛋白酶至少减少目标蛋白的收率和可能甚至阻止其产生。此外，内源蛋白酶的蛋白水解活性可导致形成片段化或降解的蛋白，这降低了宿主细胞产生的蛋白的质量。因为外肽酶对N和/或C端氨基酸的修整，蛋白可靠性可能受到蛋白水解的影响。此外，当内源蛋白酶存在于蛋白组合物中时，内源蛋白酶的存在降低了蛋白组合物的稳定性和保存期限。在需要蛋白组合物的较长保存期限或稳定性的情况下，内源蛋白酶必须从蛋白组合物中除去，或它们的蛋白酶活性必须被抑制(例如通过蛋白酶抑制剂)。已经提出了围绕上述问题的各种方案。例如，如果蛋白酶被完全鉴定和表征的话，可缺失或破坏编码各种内源蛋白酶的基因。WO90/00192描述了突变的丝状真菌宿主，其已被致使不能分泌酶促活性的天冬氨酸蛋白酶。通过这样的突变，显示异源多肽牛凝乳酶的收率可得到增加。WO2013/102674描述了丝状真菌细胞，其缺乏至少三种内源蛋白酶，且其中所述内源蛋白酶通过编码内源蛋白酶的基因的突变失活。还已尝试通过随机诱变来使内源蛋白酶失活，但它们可能对发酵性能产生未知和不需要的多效作用，例如在基因表达中的问题和宿主细胞的生长速率差。随机诱变产生在宿主细胞的整个基因组中非特异性的突变。产生对宿主细胞需要的或不需要的特征的突变的基因不能被容易地鉴定。得到的突变菌株必须原样使用，即使一些突变可能导致关于菌株和/或其产物的特征的不需要的结果。阻止内源蛋白酶的问题的另一种方法是优化原材料和培养条件，使得减少或阻止内源蛋白酶产生。然而，众所周知的是，真菌产生大量的内源蛋白酶。因此，通过单独使每种内源蛋白酶失活来定制菌株是不实际的。此外，已表明破坏一个蛋白酶基因可导致另一个或多个蛋白酶基因的表达和产生的补偿性增加。因此，开发用于工业使用的不显示源自内源蛋白酶的蛋白水解活性或显示非常低水平的源自内源蛋白酶的蛋白水解活性的丝状真菌菌株是有价值的。此外，有利的是，提供允许在宿主细胞中阻止内源蛋白酶的产生的方法。特别是，具有低的内源蛋白酶活性的里氏木霉(Trichodermareesei)将是特别合乎需要的，因为其是适合于许多重组蛋白的宿主细胞。一些酶甚至对低量的蛋白酶也特别敏感，它们可能需要进一步修饰以在产品中，例如在酶组合物中保持稳定。例如，具有多结构域结构的许多蛋白(其中各结构域通过柔性接头区连接)，例如具有纤维素结合部分的纤维素酶，可对蛋白酶裂解特别易感。因此，这样的酶可能难以开发成具有可接受的保存期限的产品，并且除了使用低蛋白酶宿主和优化培养条件以外，通常还需要精心改造连接序列。概述目的是至少部分地解决上述现有技术问题。相关的目的是提高蛋白产生，特别是这样的蛋白，其对宿主蛋白酶敏感，或当在真菌表达系统中产生时不稳定。并且，目的是提供用于在微生物中调节内源蛋白酶表达的方法。另一个目的是提供蛋白酶调节剂、编码其的基因和包含所述基因的载体。另一个目的是提供蛋白酶调节剂变体、编码其的基因和包含所述基因的载体。另一个目的是提供在宿主细胞中产生目标蛋白的方法。又一个目的是提供可供选择的多核苷酸和多肽，其在宿主细胞中调节内源蛋白酶表达。本专利技术人令人惊讶地发现，数种蛋白酶的内源表达可在宿主细胞中通过使编码蛋白酶调节剂的基因(本专利技术人称为pea1)失活而被抑制。通过在宿主细胞中阻止pea1的作用来抑制内源蛋白酶，导致例如，宿主细胞产生的重组蛋白的收率和稳定性得到改进。根据本专利技术的第一方面，提供包含编码蛋白的核苷酸序列的多核苷酸，所述蛋白包含与SEQIDNO:13的氨基酸402-533具有至少90%序列同一性的氨基酸序列，其中与包含所述多核苷酸的染色体基因未失活的宿主细胞相比，包含所述多核苷酸的染色体基因的失活导致抑制宿主细胞的内源蛋白酶的产生。本专利技术人已表明，第一方面的多核苷酸负责产生调节许多真菌内源蛋白酶的表达的基因产物。因此，该基因在本文中被称为蛋白酶调节剂、蛋白酶表达影响1或pea1，并且其特征至少为编码SEQIDNO:13的高度保守区残基402-533的序列的存在。相应的pea1基因产物(此时为多肽)在本文中被称为Pea1。抑制pea1导致内源蛋白酶表达水平降低，如下文实施例中所示。通过阻抑、下调、失活或抑制pea1表达，表明有可能抑制(即下调)真菌宿主细胞的数种内源蛋白酶的表达。内源蛋白酶活性的显著下降导致由宿主细胞表达的蛋白的较低降解，因此目标蛋白(例如由宿主细胞产生的异源重组蛋白)的收率增加。进一步的优点可在于可产生较少失活或片段化的目标蛋白，因为产生和分泌较少的内源蛋白酶。由宿主细胞产生的目标蛋白还可更不易于降解，这导致可靠性、稳定性和保存期限改进。可杂交的变体、片段和核苷酸可用于例如检测蛋白酶调节剂或与其类似的序列的存在情况。根据第一方面的多核苷酸和由其编码的基因产物可用于蛋白的工业生产。根据第二方面，提供了第一方面的多核苷酸的片段或变体。根据第三方面，提供了修饰的多核苷酸，其包含第一方面的多核苷酸和包含至少一个修饰，所述修饰导致可通过转录和/或翻译包含所述修饰的多核苷酸的染色体基因获得的基因产物不能在宿主细胞中诱导内源蛋白酶的表达。第三方面的修饰的多核苷酸编码由第一方面的多核苷酸编码的蛋白酶调节剂的失活形式或片段。其可用于使蛋白酶调节剂的正常功能失活，因此在宿主细胞中抑制内源蛋白酶表达。根据第四方面，提供了包含第一方面的多核苷酸或第二方面的片段或变体或第三方面的修饰的多核苷酸的载体。多核苷酸可插入至宿主细胞的基因组，例如在载体中。在某些实施方案中，多核苷酸可编码活性或失活形式的Pea1，和其可包含：在编码活性蛋白的基因组区域(基因座)中通过双交换或置换重组来插入分离的多核苷酸所必需的遗传元件。因此，这样的多核苷酸可用于活化或失活第一方面的编码蛋白酶调节剂的基因的方法。在一个实施方案中，载体是质粒或噬菌体载体。所述多核苷酸和载体可包含5’和3’非翻译区、将遗传构建体掺入宿主基因组的pea1的调节序列和任选的至少一种标记。根据第五方面，提供包含至少一个失活的染色体基因的宿主细胞，其中所述失活的染色体基因包含编码多肽的核酸序列，所述多肽包含与SEQIDNO:13的氨基酸402-533具有至少90%序列同一性的序列。与当染色体基因有活性或未失活时正常产生的相比，第五方面的宿主细胞可产生较少的内源蛋白酶。因此，在第五方面的宿主细胞中，宿主细胞的内源蛋白酶的蛋白降解活性可至少部分地被防止。根据第六方面，提供包含在第五方面的宿主细胞中产生的蛋白的蛋白制剂。在某些实施方案中，蛋白制剂包含根据第五方面的宿主细胞。与使用具有完整pea1的相同的宿主细胞产生的相应的蛋白制剂相比，所述蛋白制剂可具有较高含量的所述蛋白。因此，当使用蛋白制剂时，可需要较少的总体积量的蛋白制剂以获得当使用相应产生但其中蛋白酶调节剂的生本文档来自技高网...

【技术保护点】
包含至少一个失活的染色体基因的宿主细胞，其中所述失活的染色体基因包含编码多肽的核酸序列，所述多肽包含与SEQ ID NO: 13的氨基酸402‑533具有至少90%序列同一性的序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.02.20 FI 201551121.包含至少一个失活的染色体基因的宿主细胞，其中所述失活的染色体基因包含编码多肽的核酸序列，所述多肽包含与SEQIDNO:13的氨基酸402-533具有至少90%序列同一性的序列。2.权利要求1的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自来自子囊菌门(Ascomycota)、盘菌亚门(Pezizomycotina)的丝状真菌细胞；优选地选自粪壳菌纲(Sordariomycetes)、肉座菌亚纲(Hypocreomycetidae)、肉座菌目(Hypocreales)和微囊菌目(Microascales)和曲霉属(Aspergillus)、金孢子菌属(Chrysosporium)、毁丝霉属(Myceliophthora)和腐质霉属(Humicola)的成员；更优选地选自肉座菌科(Hypocreacea)、赤壳菌科(Nectriaceae)、麦角菌科(Clavicipitaceae)、微囊菌科(Microascaceae)和木霉属(Trichoderma)、肉座菌属(Hypocrea)、镰孢菌属(Fusarium)、赤霉属(Gibberella)、丛赤壳属(Nectria)、葡萄穗霉属(Stachybotrys)、麦角菌属(Claviceps)、绿僵菌属(Metarhizium)、稻曲菌属(Villosiclava)、线虫草属(Ophiocordyceps)、头孢菌属(Cephalosporium)和足放线病菌属(Scedosporium)；更优选地选自里氏木霉(Trichodermareesei)、红褐肉座菌(Hypocreajecorina)、桔绿木霉(T.citrinoviridae)、长枝木霉(T.longibrachiatum)、绿木霉(T.virens)、哈茨木霉(T.harzianum)、棘孢木霉(T.asperellum)、深绿木霉(T.atroviridae)、近里氏木霉(T.parareesei)、尖镰孢菌(Fusariumoxysporum)、禾谷镰孢菌(F.gramineanum)、假禾谷镰孢菌(F.pseudograminearum)、镶片镰孢菌(F.venenatum)、藤仓赤霉菌(Gibberellafujikuroi)、串珠赤霉菌(G.moniliformis)、玉蜀黍赤霉菌(G.zeaea)、鞭毛藻丛赤壳菌(Nectriahaematococca)、纸葡萄穗霉(Stachybotryschartarum)、S.chlorohalonata、黑麦麦角菌(Clavicepspurpurea)、黄绿绿僵菌(Metarhiziumacridum)、金龟子绿僵菌(M.anisopliae)、稻绿核菌(Villosiclavavirens)、冬虫夏草(Ophiocordycepssinensis)、顶头孢霉(Acremoniumchrysogenum)、尖端足放线病菌(Scedosporiumapiospermum)、黑曲霉(Aspergillusniger)、泡盛曲霉(A.awamori)、米曲霉(A.oryzae)、鲁克文金孢子菌(Chrysosporiumlucknowense)、嗜热毁丝霉(Myceliohpthorathermophila)、特异腐质霉(Humicolainsolens)和灰腐质霉(Humicolagrisea)；最优选是里氏木霉。3.权利要求1或2的宿主细胞，其中所述失活的染色体基因包含权利要求16-17中任一项的多核苷酸。4.权利要求1-3中任一项的宿主细胞，其中所述失活的染色体基因通过破坏、抑制所述染色体基因的翻译或转录、至少部分缺失、截短、缺失插入或突变来失活。5.权利要求1-4中任一项的宿主细胞，其包含遗传元件以允许在适合于促进表达的条件...

【专利技术属性】
技术研发人员：M帕洛赫莫，S梅金恩，P普恩特，K朱恩图恩，T普兰恩，J维马安佩拉，
申请(专利权)人：罗尔公司，
类型：发明
国别省市：芬兰,FI