一种发酵生产重组胰高血糖素样肽-1蛋白的方法技术

本发明专利技术公开了一种发酵生产重组胰高血糖素样肽‑1蛋白的方法，其特征在于，包括下列步骤：将含有编码重组胰高血糖素样肽‑1蛋白的核酸序列的基因工程菌用低磷酸盐培养基进行培养，控制培养阶段pH值和溶氧量，发酵结束后，离心去除菌体，经过纯化上清液得到所述重组胰高血糖素样肽‑1蛋白。本发明专利技术的方法能够高纯度、稳定分泌表达的GLP‑1，简化分离纯化工艺。

【技术实现步骤摘要】
一种发酵生产重组胰高血糖素样肽-1蛋白的方法
本专利技术属于多肽
，具体涉及一种发酵生产重组胰高血糖素样肽-1(GLP-1)蛋白的方法。
技术介绍
全球糖尿病发病率正处于快速增长期，根据国际糖尿病联盟(IDF)最新的公布的第七版糖尿病数据显示，2015年全球糖尿病患者人数4.15亿，患病率8.8％。全球糖尿病患病率呈快速上升趋势，预计2040年糖尿病患者数将达6.42亿，患病率将上升至10.4％。中国糖尿病患者数2015年达1.096亿，居全球首位，预计到2040年中国糖尿病患者数将达1.507亿。糖尿病常引起严重并发症，如血管病变、视网膜病、肾病和外周神经病变等传统并发症。胰高血糖素样肽-1(GLP-1)是由肠壁L-细胞分泌的激素，其作用包括刺激葡萄糖依赖性胰岛素分泌，促进胰岛素生物合成，降低血糖，保护胰岛B细胞，改善2型糖尿病的症状。此外，近年发现它还能促进神经细胞的增殖和神经发生，抑制神经细胞凋亡。据报导，目前使用基因工程表达GLP-1以融合蛋白表达为主，其工艺需要对大肠杆菌进行破碎，纯化后期需要使用酶切割，切割后再次纯化，酶切割对蛋白是否有影响，其成本昂贵，大大限制了GLP-1的产业化。因此，寻求一种更加高效和成本低的生产GLP-1的方法是非常有意义的。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种发酵生产重组胰高血糖素样肽-1蛋白的方法，其能够高纯度、稳定地分泌表达GLP-1。本专利技术所采取的技术方案是：一种发酵生产重组胰高血糖素样肽-1蛋白的方法，其包括下列步骤：将含有编码重组胰高血糖素样肽-1蛋白的核酸序列的基因工程菌用低磷酸盐培养基进行培养，控制培养阶段pH值和溶氧量，发酵结束后，离心去除菌体，经过纯化上清液得到所述重组胰高血糖素样肽-1蛋白。根据本专利技术的方法，所述编码重组胰高血糖素样肽-1蛋白的核酸序列如SEQIDNO:1所示。根据本专利技术的方法，所述基因工程菌包含表达载体phoA，所述表达载体phoA中插入有所述编码重组胰高血糖素样肽-1蛋白的核酸序列。优选的，周质分泌信号肽为pelB、phoA、ompA、ompF、ompT、lamB、SPA、StII、MalE、DsbA、TorA或HlyA中的一种。优选地，表达载体phoA中还含有STII信号肽序列。phoA为大肠杆菌碱性磷酸酶PhoA基因启动子，可以利用低磷诱导表达。相反，其他的一些启动子多是由IPTG诱导的，容易产生不溶的包涵体，同时诱导剂IPTG费用高。根据本专利技术的方法，所述基因工程菌为大肠杆菌YK537。根据本专利技术的方法，所述基因工程菌的构建步骤如下：步骤1.合成重组胰高血糖素样肽-1基因的核酸序列，在该基因的5’端引入NheI酶切位点及在3’端引入BamHI酶切位点；步骤2.构建表达载体：用NheI和BamHI双酶切分别处理所述步骤1合成的基因和表达载体phoA，37℃酶切2小时回收相应的片段用T4DNA连接酶在16℃连接过夜；连接产物转化进入大肠杆菌，在含有l00ug/mL氨苄青霉素的LB平板上挑选阳性克隆，从而构建表达载体；步骤3.将所述步骤2构建好的表达载体转化到大肠杆菌YK537中。优选地，所述步骤1中合成所述核酸序列的引物如下：引物序列GLP-1-U：GGTGCTAGCGCTCATGCTGAAGGGACCTTTACC；引物序列GLP-1-D：GGTGGATCCTCATCCTCGGCCTTTCACCAG。根据本专利技术的方法，述低磷酸盐培养基的组成为每1000ml培养基中含蛋白胨10g，酵母浸膏2.5g，MgSO4·7H2O0.5g，1mol/LpH8.0的Tris·HCl50ml，苯酚红2ml，葡萄糖10g。优选地，低磷酸盐培养基pH为7.0-8.0，更优选pH为7.0-7.4。在所述的低磷酸盐培养基中，可适时补加碳源和氮源。优选地，在所述的低磷酸盐培养基中，补加的碳源包括甘油、葡萄糖、糖蜜。更优选地，补加的碳源为甘油。优选地，在所述的低磷酸盐培养基中，补加的氮源包括有机氮源和/或无机氮源；其中有机氮源包括蛋白胨、酵母提取物(酵母浸膏或酵母浸粉)；无机氮源包括氨水或铵盐。更优选的，在所述的低磷酸盐培养基中，补加的氮源为氨水，它可以提供适量的氮源，同时起到可以调节pH值的作用。本专利技术将编码重组胰高血糖素样肽-1(GLP-1)蛋白的核酸序列插入大肠杆菌碱性磷酸酶表达载体phoA中，构建得到高效、稳定分泌表达的GLP-1大肠杆菌工程菌。经高密度发酵培养，磷浓度的高低调节诱导，GLP-1以可溶形式分泌到培养上清中，表达水平高,且具有天然活性，不但避免了粗提过程对蛋白质的破坏，而且提高了纯化收率，降低了成本。通过简便、快速的纯化方法，即获得高质量的GLP-1纯品。附图说明图1是表达载体phoA-GLP-1的质粒构建示意图。图2中是GLP-1的鉴定结果，其中，A为培养上清电泳图：1、2、3为诱导后上清；B为分子凝胶排阻层析图：1、2为洗脱峰。图3是高效液相色谱分析蛋白纯度的结果。图4是质谱检测图。表1是使用GLP-1治疗糖尿病大鼠的实验结果。具体实施方式本专利技术经过广泛而深入的研究，用优选的载体phoA进行表达，该载体含有phoA启动子，在含低浓度的磷酸盐培养基(低磷培养基)中能启动目的蛋白的表达，同时载体上带有分泌表达的信号肽，有助于GLP-1真核基因在原核中的正确折叠，并以可溶性形式分泌到培养上清中，从而简化了分离纯化工艺。下面结合具体实施例进一步阐述本专利技术，但不限于此。实施例lGLP-1表达工程菌的构建1.目的基因合成根据己知的GLP-1的天然氨基酸序列，在不改变氨基酸序列的条件下，设计GLP-1的编码序列引物。引物序列GLP-1-U：GGTGCTAGCGCTCATGCTGAAGGGACCTTTACC(SEQIDNO.2)；引物序列GLP-1-D：GGTGGATCCTCATCCTCGGCCTTTCACCAG(SEQIDNO.3)。通过搭桥PCR方法获得GLP-1的全长序列。所得到的GLP-1序列如SEQIDNO：1所示。人工合成重组GLP-1基因的核酸序列，在该基因的5’端引入NheI酶切位点及在3’端引入BamHI酶切位点。2.表达质粒phoA-GLP-1的构建与转化宿主菌专利技术人经过广泛而深入的研究，用优选的载体phoA进行表达，该载体有助于GLP-1真核基因在原核中的正确折叠，并以可溶性形式分泌培养上清中，简化了分离纯化工艺。表达质粒为本实验室保存的phoA表达载体(该表达载体含有phoA分泌信号肽)，宿主菌为大肠杆菌YK537。用NheI和BamHI双酶切分别处理基因GLP-1和表达载体phoA，37℃酶切2小时回收相应的片段用T4DNA连接酶在16℃连接过夜。连接产物转化进入大肠杆菌，在含有氨苄青霉素(l00ug/mL)的LB平板上挑选阳性克隆。表达载体phoA-GLP-1的质粒构建示意图见图1。将构建好的表达载体phoA-GLP-1按常规操作转化到大肠杆菌YK537中。实施例2工程菌高密度发酵的研究和纯化将实施例1得到的基因工程菌接种到含50mILB培养基的250ml三角烧瓶中，培养过夜。次日，将过夜培养的菌液按1：100的比例接种于低磷培养基。待OD600达到6～8，按1：100(低磷培养基)适当补加碳源(如本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种发酵生产重组胰高血糖素样肽‑1蛋白的方法，其特征在于，包括下列步骤：将含有编码重组胰高血糖素样肽‑1蛋白的核酸序列的基因工程菌用低磷酸盐培养基进行培养，控制培养阶段pH值和溶氧量，发酵结束后，离心去除菌体，经过纯化上清液得到所述重组胰高血糖素样肽‑1蛋白。

【技术特征摘要】
1.一种发酵生产重组胰高血糖素样肽-1蛋白的方法，其特征在于，包括下列步骤：将含有编码重组胰高血糖素样肽-1蛋白的核酸序列的基因工程菌用低磷酸盐培养基进行培养，控制培养阶段pH值和溶氧量，发酵结束后，离心去除菌体，经过纯化上清液得到所述重组胰高血糖素样肽-1蛋白。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述编码重组胰高血糖素样肽-1蛋白的核酸序列如SEQIDNO:1所示。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基因工程菌包含表达载体phoA，所述表达载体phoA中插入有所述编码重组胰高血糖素样肽-1蛋白的核酸序列。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述表达载体phoA中还含有STII信号肽序列。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基因工程菌为大肠杆菌YK537。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基因工程菌的构建步骤如下：步骤1.合成重组胰高血糖素样肽-1基因的核酸序列，在该基因的5’端引入NheI酶切位点及在3’端引入BamHI酶切位点；步骤2.构建表达载体：用NheI和BamHI双酶切分别...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡祥胜，王明珠，李静静，朱建斌，李昊，李东升，佘妙琴，王进辉，于莉，
申请(专利权)人：广东唯泰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44