在低共熔溶剂中使用分选酶的转酰胺反应制造技术

本文报道了酶促产生多肽的方法，其包括在低共熔溶剂中孵育i)第一多肽，包含氨基酸序列LPXTG(SEQ ID NO：01，其中X可以是任何氨基酸残基)或LPXTA(SEQ ID NO：41，其中X可以是任何氨基酸残基)，ii)第二多肽，具有i)在其N‑末端的甘氨酰基、丙氨酰基或半胱氨酰基化合物，或ii)在其N‑末端的寡聚甘氨酸、或寡聚丙氨酸或半胱氨酸氨基酸残基，随后是一至三个甘氨酸或丙氨酸氨基酸残基，或iii)其5个N‑末端氨基酸残基内的赖氨酸氨基酸残基，和iii)具有分选酶A活性的第三多肽，从而产生多肽。

Conversion reaction of sorbent enzymes in eutectic solvents

This paper reports the method of enzymatic production of polypeptide, which includes the first polypeptide, which incubate I in the low eutectic solvent, including the amino acid sequence LPXTG (SEQ ID NO:01, which X can be any amino acid residue) or LPXTA (SEQ ID ID NO:41, X can be any amino acid residue), II) the more than 2 peptide. The oligomeric glycine, or oligo alanine or cysteine residues at its N terminal, followed by one to three glycine or alanine amino acid residues, or III), and the amino acid residues of the lysine residues in the 5 N terminal amino acid residues, and III) have a separation. The more than 3 peptide of the enzyme A activity, which produces the polypeptide.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】在低共熔溶剂中使用分选酶的转酰胺反应在此报道了一种使用分选酶在低共熔溶剂中的转酰胺反应。专利技术背景低共熔溶剂(DES)是无水溶液，熔点低于100℃。DES基于氢键。在DES中，水和有机溶剂的性质相结合。大多数DES在适合生物催化的温度下是液体。DES比水更具疏水性，然而在一些情况下，它们不会导致疏水性诱导的生物催化剂失活(Gorke，J.等人，Biotechnol.BioprocessE15(2010)40-53)。此外，低共熔溶剂可以生产为无水，因此对水解是惰性的。离子液体具有与DES相似的性质，但更难以生产并且对环境更有害。蛋白酶在DES中显示出活性(Zhao，H.等人，J.Mol.Catal.B-Enzym72(2011)163-167)。此外，一些研究表明DES是比常规有机溶剂更多的与酶相容的溶剂(Gorke，JT等人，Chem.Commun.(2008)1235-1237；Lindberg，D.等人，J.Biotechnol147(2010)169-171)。对于几种酶催化反应表现出最佳性能的DES是氯化胆碱和甘油以1：2的摩尔比的混合物(Gorke，JT等人，Chem.Commun.(2008)1235-1237；Zhao，H.等人，J.Mol.Catal.B-Enzym72(2011)163-167)。分选酶A(SrtA)是将蛋白质共价附着至细菌细胞壁的膜结合酶。SrtA底物上的特异性识别基序是LPXTG，由此该酶在残基苏氨酸和甘氨酸之间切割。肽聚糖上的识别基序是五甘氨酸基序。已显示N端上的三甘氨酸和甚至二甘氨酸基序足以支持SrtA反应(Clancy,K.W.等,Peptidescience94(2010)385-396)。反应通过硫酯酰基-酶中间体进行，该中间体通过来自寡聚甘氨酸的胺亲核体的攻击而分解，将肽聚糖共价连接至蛋白质底物，并再生SrtA。SrtA可以用于将化学合成的肽共价缀合至重组表达的蛋白质。用于技术生物缀合的适用分选酶有限。最广泛使用的金黄色葡萄球菌分选酶A(St.au.SrtA)显示出用于技术应用的合适的转化动力学，但具有有限的底物谱，仅识别LPXTG分选酶-基序。St.au.SrtA缺乏N-末端膜锚定基序，已被用于细胞表面蛋白质标记，共价蛋白质固定以及将新功能整合到蛋白质中。对于正交/双重标记策略，需要具有新的底物光谱的分选酶。同样适用于标准分选酶介导的生物缀合方法，其中产品中的LPXTG基序例如对其结构和/或功能有负面影响。因此，具有不同于LPXTG的识别序列的分选酶将具有高价值。酿脓葡萄球菌SrtA(St.py.SrtA)识别LPXTA分选酶-基序，然而酶的转化动力学参数在技术规模上将其转化为不合适的分选酶。在文献中报道了接受与LPXTG不同的分选酶-基序的分选酶。其下有野生型例如来自酿脓链球菌的分选酶A(St.py.SrtA)和来自艰难梭菌的分选酶A(Cl.di.SrtA)以及工程化分选酶。除了St.py.SrtA，被报道的分选酶都不识别LPXTA基序(参见例如vanLeeuwen，HC等人，FEBSLett.588(2014)4325-4333；Dorr，BM等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2014)13343-13348；Bentley，ML等人，J.Biol.Chem.282(2007)6571-6581；Race，PR等人，J.Biol.Chem.284(2009)6924-33；Antos，JM等人，J.Am.Chem.Soc.131(2009)10800-10801)。分选酶反应在水溶液中进行，这有几个缺点。一个是许多化合物在水中的溶解度低-这对于许多荧光团尤其如此。此外，分选酶具有非常低的Km，使得疏水底物不能进入分选酶反应(Chen，I.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA108(2011)11399-11404)。然而，与荧光团连接的抗体/结合蛋白可能是生物缀合中最重要的应用(Shreve，P.和Aisen，AM，Magneticresonanceinmedicine：officialjournaloftheSocietyofMagneticResonanceinMedicine/SocietyofMagneticResonanceMedicine3(1986)336-340；Drapkin，RL等人，Am.J.Hematol.7(1979)163-172)。另一个问题是在反应过程中形成的酶中间体，它可以被水解而导致产物损失。这使得无水和有机溶剂成为水的有趣替代。然而，分选酶在有机溶剂中不稳定，例如超过20％的二甲基亚砜(DMSO)会降低分选酶活性(Pritz，S.(2008)EnzymatischeLigationvonPeptiden，Proteinen)。在WO2010/087994中报道了用于连接的方法及其用途。Marvin，J.S.等人报道了针对IgG样双特异性抗体的重组方法(ActaPharmacolSinica26(2005)649-658)。在WO2013/003555中报道了使用分选酶来安装用于蛋白质连接的点击化学柄。Strijbis，K等人(Traffic13(2012)780-789)报道了使用分选酶在活细胞中进行蛋白质连接。他们已经表明，Ca2+依赖型金黄色葡萄球菌分选酶A在细胞内是非功能的，但是Ca2+非依赖型酿脓链球菌分选酶A在酿酒酵母和哺乳动物HEK293T细胞的胞质溶胶和内质网(ER)腔中是有功能的。Levary，D.A.等人报道了由分选酶A催化的蛋白质-蛋白质融合(PLOSONE6(2011))。Madej，M.P.等人报道了通过分选酶A介导的蛋白质连接将抗表皮生长因子受体抗体工程化为单链形式并标记(Biotechnol.Bioeng.109(2012)1461-1470)。Ta，H.T.等人报道了酶促单链抗体标记作为心血管疾病中靶向分子成像和细胞归巢的通用方法(Cir.Res.109(2011)365-373)。Popp，M.等人报道了使用分选酶制造并破坏肽键-蛋白质工程化(Angew.Chem.Int.Ed.Eng.50(2011)5024-5032)。WO2010/099536中报道了对DOTA螯合物具有高亲和力的工程化蛋白质。已报道了阻断分选酶的逆反应的不同努力。Yamamura,Y.等(Chem.Commun.47(2011)4742-4744)报道了通过在底物识别位点附近引入β-发夹，在连接位点附近诱导β-发夹结构来增强分选酶A介导的蛋白质连接。Biswas,T.等(Biochem.53(2014)2515-2524)报道了通过原型分选酶A分选LPXTG肽、不变底物残基在调节酶动力学中的作用及生产底物的构象特征。Li,Y.M.等报道了通过使用分选酶来使蛋白质发生不可逆位点特异性肼解(Angew.Chem.Int.Ed.Engl.53(2014)2198-2202)。Ling和同事们展示了经由分选酶引入硫酯(Ling，J.J.J.等人，J.Am.Chem.Soc.134(2012)10749-10752)。Lindberg，D.等人(J.Biotechn本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种酶促产生多肽的方法，包括以下步骤‑在低共熔溶剂中孵育i)第一多肽，其包含氨基酸序列LPXTG(SEQ ID NO：01，其中X能够是任何氨基酸残基)或LPXTA(SEQ ID NO：41，其中X能够是任何氨基酸残基)，ii)第二多肽，其具有i)在其N‑末端的甘氨酰基、丙氨酰基或半胱氨酰基化合物，或ii)在其N‑末端的寡聚甘氨酸、或寡聚丙氨酸或半胱氨酸氨基酸残基，随后是一至三个甘氨酸或丙氨酸氨基酸残基，或iii)其5个N‑末端氨基酸残基内的赖氨酸氨基酸残基，和iii)具有分选酶A活性的多肽，并且因而产生多肽。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.09.25 EP 15186955.9;2016.06.02 EP 16172623.71.一种酶促产生多肽的方法，包括以下步骤-在低共熔溶剂中孵育i)第一多肽，其包含氨基酸序列LPXTG(SEQIDNO：01，其中X能够是任何氨基酸残基)或LPXTA(SEQIDNO：41，其中X能够是任何氨基酸残基)，ii)第二多肽，其具有i)在其N-末端的甘氨酰基、丙氨酰基或半胱氨酰基化合物，或ii)在其N-末端的寡聚甘氨酸、或寡聚丙氨酸或半胱氨酸氨基酸残基，随后是一至三个甘氨酸或丙氨酸氨基酸残基，或iii)其5个N-末端氨基酸残基内的赖氨酸氨基酸残基，和iii)具有分选酶A活性的多肽，并且因而产生多肽。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述具有分选酶A活性的第三多肽衍生自金黄色葡萄球菌分选酶A或单核细胞增生李斯特菌分选酶A。3.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，其中所述方法用于两种多肽的酶促缀合。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述低共熔溶剂包含氯化胆碱。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述低共熔溶剂是氯化胆碱以1:2的摩尔比与甘油或以1：3的摩...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·沙特，M·伯尼茨杜拉特，
申请(专利权)人：豪夫迈·罗氏有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士,CH