本发明专利技术涉及抗生素生产技术领域，具体涉及一种达托霉素提取方法。包括如下步骤：步骤(1)将达托霉素发酵液进行陶瓷膜过滤；步骤(2)将过滤液过大孔吸附树脂收集洗脱液；步骤(3)将所得的洗脱液调上NM-Q阴离子交换树脂洗脱，收集洗脱液；步骤(4)将步骤(3)所得洗脱液过反相硅胶NMsil-C18柱，用醋酸铵乙醇溶液梯度洗脱柱子，收集洗脱液；步骤(5)将步骤(4)所得的达托霉素洗脱液浓缩，加入乙酸钙和异丙醇，放置，析晶，抽滤，烘干得达托霉素结晶粉。本发明专利技术的有益效果在于：本发明专利技术的达托霉素提取方法不使用剧毒性的乙腈溶液作为洗脱液，减少对环境和生产人员健康压力，并且酸碱调节试剂使用减少，降低了生产成本。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及抗生素生产
，具体涉及。
技术介绍
病原菌对抗生素产生耐药性是当今全球面临的严峻挑战之一，寻找能有效抑制抗 药菌的抗生素是解决这一问题的根本途径。万古霉素，曾被认为是抗革兰氏阳性菌的最后 一道防线，然而全世界范围内临床上发现了越来越多的耐此药菌。达托霉素是一类称为环酯肽类新抗生素家族的第一个产品。它是从小链霉菌 (Streptomyces parvus)发酵液当中提取得到的十三个氨基酸组成的结构新颖的环脂肽类 抗生素，其中十个氨基酸构成环状结构，在环外癸酸和色氨酸发生酯化。它不仅具有新颖的 化学结构，且其作用模式也与任一已获准抗生素不同。它能在多个方面破坏细菌细胞膜功 能，由此迅速杀死革兰阳性菌。达托霉素除能作用于大多数临床相关革兰阳性菌外，更重要 的是在体外对已呈甲氧西林(methicillin)、万古霉素和利奈唑胺等耐药性分离菌株仍具 强力活性。达托霉素(Daptomycin)被公认为在万古霉素之后的最佳备用抗生素，是美国礼莱 公司20世纪80年代发现的新型脂肽类抗生素，对MRSA (耐甲西林金黄葡萄球菌)有明显的抑 制作用，除抗MRSA之外，达托霉素还对绝大多数的革兰氏阳性菌有抑制作用。据报道，达托 霉素对2002~2005年从美国和加拿大各医院收集的19615株临床革兰氏阳性菌中的99 %存 在抑制作用。自从2003年9月FDA首次批准Cubicin(Daptomycin注射剂）用于治疗复杂皮肤 和皮肤结构感染以来，达托霉素在临床上应用越来越多，市场上对达托霉素的需求量越来 越大。 但是达托霉素为发酵产物，通过发酵培养得到的发酵滤液，发酵过程中会产生大 量的色素及与达托霉素结构相近似的副产物如脱水达托霉素，因此达托霉素的提取纯化方 法较复杂。一般达托霉素产生菌，生产能力不稳定，产量较低，发酵副产物较多，杂质较多， 导致后提取工作较为复杂，大大地增加了后序的提纯难度，难以获得高纯度的最终产物，从 而无法产业化生产。 目前美国cubist制药公司掌握达托霉素的全球独家开发、生产及销售权，国内也 有很多家机构正在研究中，但是适用于工业化生产、产能的制备高纯度达托霉素的有效技 术还比较缺乏。文献资料《达托霉素发酵液大孔树脂吸附分离的研究》（中国抗生素杂志2008年2 月第33卷第2期)介绍了达托霉素发酵液运用大孔树脂富集的方法。这份文献公开的达托霉 素的提取纯化方法存在操作步骤复杂，发酵液色素和杂质难去除，最终产品色泽深和纯度 不高等问题，而且，不同菌种发酵产生的不同发酵液不一定能用相同的提取方法。 因此寻找更有效的脱色方法和更简便的提取纯化方法，才有可能实现达托霉素的 工业化生产。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是:提供一种环境友好、成本低的达托霉素的提取方 法。 为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案为:提供， 包括如下步骤： 步骤(1)将达托霉素发酵液进行陶瓷膜过滤，收集过滤液； 步骤(2)将步骤（1)所得过滤液过大孔吸附树脂HZ801柱吸附，吸附完后水洗至漏 出液接近无色，用乙醇洗脱树脂收集得到达托霉素单位大于l〇〇mg/L的洗脱液； 步骤(3)将步骤(2)所得的洗脱液调PH至4.0-8.0,上匪-Q阴离子交换树脂，纯化水 顶洗后，用氯化钠溶液梯度洗脱，收集纯度大于90 %的达托霉素洗脱液； 步骤（4)将步骤（3)所得的达托霉素洗脱液过反相硅胶匪Sil-C18柱，调其PH至 4.0-8.0，流速0.5-6BV/h上柱，用10-300mmol/L醋酸铵乙醇溶液梯度洗脱柱子，收集得到纯 度大于97 %达托霉素洗脱液； 步骤（5)将步骤（4)所得的达托霉素洗脱液浓缩到达托霉素浓度为20000-80000mg/L得浓缩液，加入浓缩液的达托霉素质量的10 %-90 %的乙酸钙，浓缩液体积50 %-90 %的异丙醇，放置36-48h，析晶，抽滤，烘干得达托霉素结晶粉。 优选的，上述的达托霉素提取方法中，所述步骤（1)具体为:将达托霉素发酵液进 行陶瓷膜过滤，浓缩至体积一半后，边加水顶洗边过滤，保持加水量和过滤流量一致，持续 至总滤液体积为发酵液体积的2-5倍量时，停止过滤，收集过滤液。 优选的，上述的达托霉素提取方法中，所述步骤(2)具体为:将步骤(1)所得过滤液 过大孔吸附树脂HZ801柱吸附，流速0.8BV/h，吸附完后水洗至漏出液接近无色，先用体积百 分数为20%乙醇溶液预洗，再用体积百分数为60%乙醇溶液进行洗脱树脂收集得到达托霉 素单位大于1 〇〇mg/L的洗脱液。 优选的，上述的达托霉素提取方法中，所述步骤(3)中"用氯化钠溶液梯度洗脱"具 体为:依次用25mM氯化钠溶液，50mM氯化钠溶液，60mM氯化钠溶液，90mM氯化钠溶液进行梯 度洗脱。 优选的，上述的达托霉素提取方法中，所述步骤(3)中"用氯化钠溶液梯度洗脱"具 体为：以5BV/h流速先用25mmol/L氯化钠溶液冲洗10BV除杂质，然后用50mmol/L氯化钠溶液 冲洗6BV并收集被洗脱下的达托霉素，用60mmol/L氯化钠溶液冲洗15BV，收集被洗脱下来的 达托霉素，最后用90mmol/L氯化钠溶液冲洗6BV。优选的，上述的达托霉素提取方法中，所述步骤(4)中"用10-300mmol/L醋酸铵乙 醇溶液梯度洗脱柱子"具体为:先用含乙醇体积分数为20 %的乙醇-20mmol/L醋酸铵溶液预 洗1BV，再用含乙醇体积分数为38 %乙醇-20mmol/L醋酸铵溶液洗脱。 优选的，上述的达托霉素提取方法中，步骤(5)中"将步骤(4)所得的达托霉素洗脱 液浓缩到达托霉素浓度为20000-8000011^/1；'具体为 :将步骤(4)所得的达托霉素洗脱液浓 缩到单位50000mg/L，调其PH到4 · 8。 优选的，上述的达托霉素提取方法中，还包括步骤(6):将步骤(5)所得达托霉素结 晶粉溶解于水中，过HZ016树脂脱盐，洗脱液按1/10倍量加入活性炭脱色除内毒素，过滤，滤 液加入10倍量的异丙醇进行沉淀，将所得达托霉素沉淀粉进行沸腾干燥得到达托霉素成 品。其中，步骤5中结晶加入大量醋酸钙，得到的结晶粉灰分超标，需要重新溶解过脱盐树脂 除去灰分，再加活性炭除内毒素，最后沉淀干燥得到成品。 优选的，上述的达托霉素提取方法具体包括如下步骤： 步骤（1)将达托霉素发酵液30L，所述达托霉素发酵液达托霉素的含量为2000mg/ L，进行陶瓷膜过滤，浓缩至体积一半后，边加水顶洗边过滤，保持加水量和过滤流量一致， 持续至总滤液体积为发酵液体积的5倍量时，停止过滤。得到滤液160L，达托霉素含量为 340mg/L； 步骤(2):步骤（1)得到的滤液过大孔吸附树脂HZ801柱吸附，流速0.8BV/h，吸附完 后水洗至漏出液接近无色，先用体积百分数为20%乙醇预洗，再用体积百分数为60%乙醇 进行洗脱树脂收集达托霉素单位大于lOOmg/l的洗脱液，得到洗脱液9L，达托霉素含量为 5700mg/L； 步骤(3):步骤(2)得到的洗脱液，用20000道尔顿的超滤膜进行超滤后，纳滤浓缩， 超滤和过滤时温度控制在15-20度，浓缩至达托霉素单位15000-16000,调PH值至6.5,流速 5BV/h上匪-Q阴本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种达托霉素提取方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤(1)：将达托霉素发酵液进行陶瓷膜过滤，收集过滤液；步骤(2)：将步骤(1)所得过滤液过大孔吸附树脂HZ801柱吸附，吸附完后，水洗至漏出液接近无色，用乙醇洗脱树脂收集得到达托霉素单位大于100mg/L的洗脱液；步骤(3)：将步骤(2)所得的洗脱液调PH至4.0‑8.0，上NM‑Q阴离子交换树脂，纯化水顶洗后，用氯化钠溶液梯度洗脱，收集得到纯度大于90％的达托霉素洗脱液；步骤(4)：将步骤(3)所得的达托霉素洗脱液过反相硅胶NMsil‑C18柱，调其PH至4.0‑8.0，流速0.5‑6BV/h上柱，用10‑300mmol/L醋酸铵乙醇溶液梯度洗脱柱子，收集得到纯度大于97％达托霉素洗脱液；步骤(5)：将步骤(4)所得的达托霉素洗脱液浓缩到达托霉素浓度为20000‑80000mg/L得浓缩液，加入浓缩液的达托霉素质量的10％‑90％的乙酸钙，浓缩液体积50％‑90％的异丙醇，放置36‑48h，析晶，抽滤，烘干得达托霉素结晶粉。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：黄志强，黄娟，赵正国，林东态，蒋永飞，巫秋萍，
申请(专利权)人：丽珠集团福州福兴医药有限公司，
类型：发明
国别省市：福建;35
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