本发明专利技术涉及一种重组粉尘螨2类变应原及其编码基因和制备方法，发明专利技术人将Der f2基因在毕赤酵母表达系统中进行了优化，并在分子设计时加入了提高Der f2表达的作用原件。经过基因优化后Der f2与现有技术相比具有更高的表达量，且经过本专利纯化工艺获得的重组Der f2与天然蛋白相比具有相似的生物学活性。
A recombinant allergen protein of Dermatophagoides Dermatophagoides and its preparation and Application
The invention relates to a recombinant 2 allergen and its encoding gene and preparation method. The inventor optimizes the Der F2 gene in the Pichia pastoris expression system and added the original part to improve the expression of Der F2 in the molecular design. After gene optimization, Der F2 has a higher expression compared with the existing technology, and the recombinant Der F2 obtained by this patent purification process has similar biological activity compared with natural protein.
【技术实现步骤摘要】
一种重组粉尘螨2类变应原蛋白及其制备方法与应用
本专利技术属于生物工程基因领域，涉及一种重组粉尘螨2类变应原及其编码基因和表达纯化方法。
技术介绍
尘螨种类繁多，广泛存在于人类生活和工作环境中，其排泄物、代谢物及螨体均具有较强的变应原型，据统计全球约10％的人口尘螨过敏，约80％的外源性哮喘由尘螨引起。目前，临床上主要采用尘螨变应原粗提液治疗尘螨引起的变态反应性疾病，例如2006年上市的浙江我武生物的“畅迪”粉尘螨滴剂即为粉尘螨代谢培养物的提取液。尘螨变应原主要存在于排泄物和螨体中，采用提取方法耗时长，过程繁琐，成本较高；此外天然变应原提取液的组成非常复杂，恒定其组分非常困难，且容易受到外源性有毒物质、病原体微生物的污染。长期使用尘螨变应原粗提液易导致红晕、肿胀、硬结、坏死等局部反应和休克、水肿、支气管痉挛、荨麻疹、血管性水肿、全身性红斑等全身反应。此外，采用粗提液进行诊断，无法明确患者对变应原各组分的反应程度，易致误诊。变应原的质量对变态反应疾病的诊断和治疗至关重要，用于免疫诊治的变应原应该是纯品而不宜为粗提取液。重组变应原与粗提液相比具有以下优势：(1)重组变应原具有更高的纯度，与粗提液相比不含非变应原成分、酶类、酶抑制剂和毒性蛋白等；(2)重组蛋白成分单一、具有较好的特异性，粗提液中成分复杂，患者可能只与其中部分成分反应，特异性差；(3)重组变应原与天然提取液相比减少了IgE结合的抗原表位，有效降低IgE介导的过敏反应，同时保留变应原T细胞识别所必须的结构域，具有较好的免疫原性，减少免疫治疗的危险性，提高脱敏治疗的效果。尘螨变应原组成复杂，约有30余种，其中1类和2类变应原是最主要的变应原组分。在尘螨过敏患者血清中，70-80％的患者的IgE结合粉尘螨的2类变应原(Derf2)，并呈现强阳性反应。Derf2前体由146个氨基酸组成，经过去除信号肽加工处理后为129个氨基酸，分子量为14KD，无糖基化位点。目前针对Derf2重组表达比较具有代表性的是胡友莹等2011年在原核表达系统中进行的研究，以及2012年崔玉宝等申请的“一种生产重组粉尘螨变应原Derf1和Derf2融合蛋白的方法”(中国专利号：CN102676568A)，但原核表达系统无翻译后修饰的功能，得到的Derf2蛋白结构不正确，与血清反应性较弱，且后期分离纯化困难。
技术实现思路
为了克服以上缺点，专利技术人将Derf2基因在毕赤酵母表达系统中进行了优化，并在分子设计时加入了提高Derf2表达的作用原件，专利技术人惊喜地发现，经过基因优化后Derf2与现有技术相比具有更高的表达量，且与天然蛋白相比具有相似的生物学活性。本专利技术的一个目的是提供一种编码Derf2蛋白的DNA序列，其碱基序列如SEQIDNO:1所示。该序列针对毕赤酵母表达系统进行了密码子优化，其更利于Derf2在毕赤酵母中表达。本专利技术的另一个目的是提供一种Derf2蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO:3所示。本专利技术的另一个目的是提供一种含有上述编码优化后Derf2基因的载体，优选的，所述的载体为pAO815，pPIC9，pPIC9K，pPIC3.5，pPIC3.5K，pPICZA、B、C或pGAPZA、B、C，更优选为pPIC3.5K，pPICZA或pGAPZA。本专利技术的另一个目的是提供一种包含上述所述载体的毕赤酵母菌株，优选的，所述毕赤酵母菌株为SMD1168、GS115、KM71、X33或KM71H，更优选为KM71或X-33菌株。作为优选，编码Derf2蛋白的DNA序列与毕赤酵母上AOX1的ATG仅相差242bp；编码Derf2蛋白的DNA序列前加入Kozak序列GCCACCATGG。本专利技术的另一个目的是提供一种Derf2蛋白的表达方法，所述方法包含下述步骤：A.构建含有上述编码Derf2基因的载体；B.将步骤A的载体线性化后转入毕赤酵母菌株中，并在合适的条件下培养；C.回收纯化蛋白质。上述所述载体优选为pPIC3.5K，pPICZA或pGAPZA。上述所述毕赤酵母菌株优选为KM71或X33菌株。更优选的，上述所述载体为pPICZA，并且上述所述毕赤酵母菌株为X33菌株。本专利技术的另一个目的是提供一种重组Derf2蛋白纯化方法，所述纯化方法如下：A.将Derf2发酵液低温高速离心收集上清，50mM乙酸钠，pH＝4.0缓冲液超滤，0.45μm滤膜过滤。B.第一步阳离子层析，用平衡缓冲液平衡层析柱，接着运用纯化系统将步骤A中预处理的发酵液通过分离填料，然后运用洗脱缓冲液梯度洗脱，收集洗脱峰，平衡缓冲液为50mM乙酸钠，pH＝4.0，洗脱缓冲液为50mM乙酸钠，1.0M氯化钠，pH＝4.0。C.第二步首先将B中收集得到的Derf2蛋白峰用20mM磷酸盐，pH＝6.0溶液超滤，平衡缓冲液平衡层析柱，将超滤的Derf2蛋白溶液上阴离子层析填料，收集穿透峰，平衡缓冲液为20mM磷酸盐，pH＝6.0。D.第三步将C中穿透峰加入硫酸铵至终浓度1.5M，pH＝6.0，平衡缓冲液平衡层析柱，Derf2样品上疏水层析填料，洗脱缓冲液梯度洗脱，平衡缓冲液为1.5M硫酸铵，20mM磷酸盐，pH＝6.0，洗脱缓冲液为20mM磷酸盐，pH＝6.0。本专利技术的另一个目的是提供重组Derf2蛋白在制备治疗尘螨变态反应性疾病药物中的应用。所述变态反应性疾病为过敏性鼻炎、过敏性哮喘等。本专利技术的重组Derf2蛋白具有较高的表达量，且与天然蛋白具有相似的生物学活性。附图说明图1表示优化前后重组Derf2基因序列对比图。其中优化前序列对应的为天然Derf2基因核苷酸序列；优化后序列对应的为本专利技术的重组Derf2的基因核苷酸序列，即密码子优化后的序列。图2-a，图2-b为优化前后Derf2基因在毕赤酵母表达系统中的CAI指数。其中，图2-a表示天然Derf2基因核苷酸序列在毕赤酵母表达系统中CAI指数经程序计算为0.80；图2-b表示优化后的本专利技术的Derf2密码子在毕赤酵母表达系统中CAI指数经程序计算为0.90。图3-a，3-b为密码子优化前后Derf2基因在毕赤酵母表达宿主中最优密码子频率分布区域图。其中图3-a表示Derf2天然基因核苷酸序列在毕赤酵母系统中最优密码子频率分布区域图，从图中可以看出：Derf2天然基因核苷酸序列的低利用率密码子出现百分比为5％；图3-b表示优化后的本专利技术的Derf2密码子在毕赤酵母系统中最优密码子频率分布区域图，优化后的本专利技术的Derf2密码子序列低利用率密码子出现为0。图4-a，4-b为密码子优化前后Derf2基因在毕赤酵母表达系统中平均GC碱基含量分布区域图。其中，图4-a表示Derf2天然基因核苷酸序列在毕赤酵母表达系统中平均GC碱基含量为：39.37％；图4-b表示优化后的本专利技术的Derf2密码子在毕赤酵母表达系统中平均GC碱基含量为：44.93％。图5为密码子优化后Derf2基因PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图。其中，泳道1为500bpDNALadder；泳道2为两端含有EcoRI和XhoI酶切位点的重组Derf2基因PCR产物。图6为密码子优化后Derf2表达质粒pPICZ-Derf2构建过程图。图7为密码子优化后Derf2基因在宿主工程菌中的表达鉴定图。其中，图7-a为本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.编码Der f2蛋白的DNA序列，其碱基序列如SEQ ID NO:1所示。
【技术特征摘要】
2016.12.31 CN 20161126724751.编码Derf2蛋白的DNA序列，其碱基序列如SEQIDNO:1所示。2.重组Derf2蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO:3所示。3.含有权利要求1所述编码Derf2基因的载体，所述的载体为pAO815，pPIC9，pPIC9K，pPIC3.5，pPIC3.5K，pPICZA、B、C或pGAPZA、B、C。4.包含权利要求3所述载体的毕赤酵母菌株，所述毕赤酵母菌株为SMD1168、GS115、KM71、X33或KM71H。5.权利要求4所述毕赤酵母菌株，其特征在于编码Derf2蛋白的DNA序列与毕赤酵母上AOX1的ATG相差242bp；编码Derf2蛋白的DNA序列前加入Kozak序列GCCACCATGG。6.重组Derf2蛋白的表达方法，所述方法包含下述步骤：A.构建含有如权利要求1所述编码Derf2基因的载体；B.将步骤A的载体线性化后转入毕赤酵母菌株中，并在合适的条件下培养；C.回收纯化蛋白质。7.重...
【专利技术属性】
技术研发人员：马永，范宇，何青，王俊，王安良，
申请(专利权)人：江苏众红生物工程创药研究院有限公司，常州京森生物医药研究所有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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