本发明专利技术涉及一种重组粉尘螨I型变应原及其编码基因和制备方法，发明专利技术人将proDer f1基因在毕赤酵母表达系统中进行了优化，并在分子设计时加入了提高proDer f1表达的作用原件。经过基因优化后proDer f1与现有技术相比具有更高的表达量，且经过本发明专利技术纯化工艺获得的重组Der f1与天然蛋白相比具有相似的生物学活性。
Recombinant allergen protein of Dermatophagoides dermite 1 and its preparation method and Application
The invention relates to a recombinant allergens I type allergens, their encoding genes and preparation methods. The inventor optimizes the proDer F1 gene in Pichia pastoris expression system, and added the original part to improve the expression of proDer F1 in the molecular design. After the gene optimization, proDer F1 has a higher expression compared with the existing technology, and the recombinant Der F1 obtained by this purification process has similar biological activity compared with the natural protein.
【技术实现步骤摘要】
一种重组粉尘螨1类变应原蛋白及其制备方法和应用
本专利技术属于生物工程基因领域，涉及一种重组粉尘螨1类变应原及其编码基因和表达纯化方法。
技术介绍
尘螨种类繁多，广泛存在于人类生活和工作环境中，其排泄物、代谢物及螨体均具有较强的变应原型，据统计全球约10％的人口尘螨过敏，约80％的外源性哮喘由尘螨引起。目前，临床上主要采用尘螨变应原粗提液治疗尘螨引起的变态反应性疾病，例如2006年上市的浙江我武生物的“畅迪”粉尘螨滴剂即为粉尘螨代谢培养物的提取液。尘螨变应原主要存在于排泄物和螨体中，采用提取方法耗时长，过程繁琐，成本较高；此外天然变应原提取液的组成非常复杂，恒定其组分非常困难，且容易受到外源性有毒物质、病原体微生物的污染。长期使用尘螨变应原粗提液易导致红晕、肿胀、硬结、坏死等局部反应和休克、水肿、支气管痉挛、荨麻疹、血管性水肿、全身性红斑等全身反应。此外，采用粗提液进行诊断，无法明确患者对变应原各组分的反应程度，易致误诊。变应原的质量对变态反应疾病的诊断和治疗至关重要，用于免疫诊治的变应原应该是纯品而不宜为粗提取液。重组变应原与粗提液相比具有以下优势：(1)重组变应原具有更高的纯度，与粗提液相比不含非变应原成分、酶类、酶抑制剂和毒性蛋白等；(2)重组蛋白成分单一、具有较好的特异性，粗提液中成分复杂，患者可能只与其中部分成分反应，特异性差；(3)重组变应原与天然提取液相比减少了IgE结合的抗原表位，有效降低IgE介导的过敏反应，同时保留变应原T细胞识别所必须的结构域，具有较好的免疫原性，减少免疫治疗的危险性，提高脱敏治疗的效果。尘螨变应原组成复杂，约有30余种，其中1类和2类变应原是最主要的变应原组分。目前对粉尘螨的1类变应原(Derf1)研究最全面的是日本学者ToshiroTakai等在2005年进行的研究，文章表明Derf1在毕赤酵母系统中表达时需要加入Derf1蛋白的前肽(带前肽的Derf1，记为proDerf1)，否则无法在真核表达系统中进行表达，然后再经过活化过程得到与天然蛋白氨基酸序列一致的成熟的Derf1蛋白；文章中未对proDerf1基因进行优化，产量较低，暂时还没有更进一步的研究报道。
技术实现思路
为了克服以上缺点，专利技术人将proDerf1基因在毕赤酵母表达系统中进行了优化，并在分子设计时加入了提高proDerf1表达的作用原件，专利技术人惊喜地发现，经过基因优化后proDerf1与现有技术相比具有更高的表达量；此外，专利技术人对proDerf1的活化工艺进行了深入研究和优化，采用了更具有操作性和可放大的活化工艺，经过纯化后的成熟Derf1蛋白与天然蛋白相比具有相似的生物学活性。本专利技术的一个目的是提供一种编码proDerf1蛋白的DNA序列，其碱基序列如SEQIDNO:1所示。该序列针对毕赤酵母表达系统进行了密码子优化，其更利于proDerf1在毕赤酵母中表达。本专利技术的另一个目的是提供一种proDerf1蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO:3所示。本专利技术的另一个目的是提供一种Derf1蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO:4所示本专利技术的另一个目的是提供一种含有上述编码优化后proDerf1基因的载体，优选的，所述的载体为pAO815，pPIC9，pPIC9K，pPIC3.5，pPIC3.5K，pPICZαA、B、C或pGAPZαA、B、C，更优选为pPIC3.5K，pPICZαA或pGAPZαA。本专利技术的另一个目的是提供一种包含上述所述载体的毕赤酵母菌株，优选的，所述毕赤酵母菌株为SMD1168、GS115、KM71、X33或KM71H，更优选为KM71或X33菌株。作为优选，编码proDerf1蛋白的DNA序列与毕赤酵母上AOX1的ATG仅相差242bp；编码proDerf1蛋白的DNA序列前有alpha-factor信号肽和Kozak序列GCCACCATGG。本专利技术的另一个目的是提供一种proDerf1蛋白的表达方法，所述方法包含下述步骤：A.构建含有上述编码proDerf1基因的载体；B.将步骤A的载体线性化后转入毕赤酵母菌株中，并在合适的条件下培养；C.回收纯化蛋白质。上述所述载体优选为pPIC3.5K，pPICZαA或pGAPZαA。上述所述毕赤酵母菌株优选为KM71或X33菌株。更优选的，上述所述载体为pPICZαA，并且上述所述毕赤酵母菌株为X33菌株。本专利技术的另一个目的是提供一种重组Derf1蛋白纯化方法，所述纯化方法如下：A.将proDerf1发酵液低温高速离心收集上清，于5KD透析袋，25mM乙酸钠，pH＝4.5缓冲液中透析48h，0.45μm滤膜过滤。B.第一步阳离子层析，用平衡缓冲液平衡层析柱，接着运用纯化系统将步骤A中已活化的成熟的Derf1发酵液通过分离填料，然后运用洗脱缓冲液梯度洗脱，收集洗脱峰，平衡缓冲液为50mM乙酸钠，pH＝4.5，洗脱缓冲液为50mM乙酸钠，1.0M氯化钠，pH＝4.5。C.第二步首先将B中收集得到的Derf1蛋白峰用20mM磷酸盐pH＝6.0溶液超滤，平衡缓冲液平衡层析柱，将超滤的Derf1蛋白溶液上阴离子层析填料，收集穿透峰，平衡缓冲液为20mM磷酸盐，pH＝6.0。D.第三步将C中穿透峰加入硫酸铵至终浓度1.5M，pH＝6.0，平衡缓冲液平衡层析柱，Derf1样品上疏水层析填料，洗脱缓冲液梯度洗脱，平衡缓冲液为1.5M硫酸铵，20mM磷酸盐，pH＝6.0，洗脱缓冲液为20mM磷酸盐，pH＝6.0。本专利技术的另一个目的是提供重组Derf1蛋白在制备治疗尘螨变态反应性疾病药物中的应用。所述变态反应性疾病为过敏性鼻炎、过敏性哮喘等。本专利技术的重组proDerf1蛋白具有较高的表达量，且与天然蛋白具有相似的生物学活性。附图说明图1表示优化前后proDerf1基因序列对比图。其中优化前序列对应的为天然proDerf1基因核苷酸序列；优化后序列对应的为本专利技术的重组proDerf1的基因核苷酸序列，即密码子优化后的序列。图2-a，2-b为优化前后proDerf1基因在毕赤酵母表达系统中的CAI指数。其中，图2-a表示天然proDerf1基因核苷酸序列在毕赤酵母表达系统中CAI指数经程序计算为0.76；图2-b表示优化后的本专利技术的proDerf1密码子在毕赤酵母表达系统中CAI指数经程序计算为0.85。图3-a，3-b为密码子优化前后proDerf1基因在毕赤酵母表达宿主中最优密码子频率分布区域图。其中图3-a表示proDerf1天然基因核苷酸序列在毕赤酵母系统中最优密码子频率分布区域图，从图中可以看出：proDerf1天然基因核苷酸序列的低利用率密码子出现百分比为10％；图3-b表示优化后的本专利技术的proDerf1密码子在毕赤酵母系统中最优密码子频率分布区域图，优化后的本专利技术的proDerf1密码子序列低利用率密码子出现为0。图4-a，4-b为密码子优化前后proDerf1基因在毕赤酵母表达系统中平均GC碱基含量分布区域图。其中，图4-a表示proDerf1天然基因核苷酸序列在毕赤酵母表达系统中平均GC碱基含量为：41.85％；图4-b表示优化后的本专利技术的proDerf1密码子在毕赤酵母表达系统中平均GC碱基含量为：42.10％。图5为密码子优化本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.编码proDer f1蛋白的DNA序列，其碱基序列如SEQ ID NO:1所示。
【技术特征摘要】
2016.12.31 CN 20161126725071.编码proDerf1蛋白的DNA序列，其碱基序列如SEQIDNO:1所示。2.一种重组proDerf1蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO:3所示。3.一种重组Derf1蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO:4所示。4.含有权利要求1所述编码proDerf1基因的载体，所述的载体为pAO815，pPIC9，pPIC9K，pPIC3.5，pPIC3.5K，pPICZαA、B、C或pGAPZαA、B、C。5.包含权利要求3所述载体的毕赤酵母菌株，所述毕赤酵母菌株为SMD1168、GS115、KM71、X33或KM71H。6.权利要求4所述毕赤酵母菌株，其特征是编码proDerf1蛋白的DNA序列与毕赤酵母上AOX1的ATG相差242bp；编码proDerf1蛋白的DNA序列前有alpha-factor信号肽和Kozak序列GCCACCATGG。7.重组proDerf1蛋白的表达方法，所述方法包含下述步骤：A.构建含有如权利要求1所述的编码proDerf1基因的载体；B.将步骤A的载体线性化后转入毕赤酵母菌株...
【专利技术属性】
技术研发人员：马永，范宇，何青，王俊，王安良，
申请(专利权)人：江苏众红生物工程创药研究院有限公司，常州京森生物医药研究所有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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