人类MTHFR和MTRR基因检测试剂盒及其用途制造技术

本发明专利技术公开了一种人类MTHFR和MTRR基因检测试剂盒及其用途，所述试剂盒包括以下各组分：MTHFR 677/MTHFR 1298/MTRR 66三重检测液以及可选的以下组分：核酸扩增反应液、酶混合液、阳性对照和空白对照。本发明专利技术公开的人类MTHFR和MTRR基因检测试剂盒能够在同一反应管中同时检测出MTHFR基因677位点和1298位点以及MTRR基因66位点基因型。此外，该试剂盒还具有特异性强、灵敏度高，操作简便、可重复性强、检测结果快速客观等优点，本发明专利技术的提出为人类MTHFR和MTRR基因的体外检测提供了一种有效的技术手段。

Human MTHFR and MTRR gene detection kits and their uses

The present invention discloses a human MTHFR and MTRR gene detection kit and its use. The kit includes the following components: the MTHFR 677/MTHFR 1298/MTRR 66 three heavy detection solution and the optional components: nucleic acid amplification reaction fluid, enzyme mixture, positive control and blank control. The human MTHFR and MTRR gene detection kit disclosed in the present invention can simultaneously detect the 677 and 1298 loci of the MTHFR gene and the genotype of the 66 locus of the MTRR gene in the same reaction tube. In addition, the kit has the advantages of strong specificity, high sensitivity, easy operation, strong repeatability and rapid and objective detection results. The present invention provides an effective technique for the detection of human MTHFR and MTRR genes in vitro.

【技术实现步骤摘要】
人类MTHFR和MTRR基因检测试剂盒及其用途
本专利技术涉及一种人类基因组DNA基因型检测的体外诊断试剂盒，尤其涉及MTHFR和MTRR基因检测试剂盒及其用途，属于生物

技术介绍
叶酸是饮食中重要的甲基供体，参与DNA甲基化和DNA合成通路。叶酸缺少会引起人DNA中的尿嘧啶错误插入，及染色体断裂，从而导致基因组的不稳定性和突变概率的增加。叶酸代谢通路异常，会导致高同型半胱氨酸败血症。高同型半胱氨酸败血症是多种疾病的危险因子，会导致各种增加的风险，如血管和神经疾病，妊娠并发症，男性不育，新生儿缺陷，糖尿病，肾脏疾病，骨质疏松症，神经精神疾病和癌症。MTHFR(5,10-methylenetetrahydrofolatereductase)基因，编码5,10亚甲基四氢叶酸还原酶，位于第一号染色体1p36.3位置。MTHFR全长19.3kb，共有外显子12个，mRNA全长7,105bp，编码657个氨基酸残基组成的蛋白；能够催化5,10-MTHFR还原为5-甲基四氢叶酸，作为一个甲基供体，参与同型半胱氨酸到甲硫氨酸的甲基化。MTHFR基因突变主要发生在677和1298位点，677位点(C>T)突变会使基因编码的5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶的活性发生不同程度的变化，677TT使酶活性降低几乎为70％左右，677CT则是降低了35％的活性。MTHFR基因的1298位点，其多态性导致异亮氨酸被甲硫氨酸替换，从而导致同型半胱氨酸再甲基化的速率。而据相关文献研究，1298位点的突变可以和677位点的突变发生协同效应，导致5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶的活性进一步的降低。MTRR(5-methyltetrahydrofolate-homocysteinemethyltransferasereductase)基因，编码甲硫氨酸合成酶还原酶，位于染色体5p15.3-p15.2位置，MTRR基因全长32021kb，mRNA全长3274bp，共有15个外显子，编码具有726个氨基酸的蛋白质。MTRR编码的甲硫氨酸合成酶还原酶能够通过还原型甲基化作用重新生成具有功能活性的甲硫氨酸合酶。MTRR基因的66位点(A>G)突变会对叶酸DNA甲基化代谢途径产生影响。现有的针对MTHFR和MTRR基因检测的体外诊断试剂盒大多采用单重荧光PCR反应，或者直接采用直接测序法，焦磷酸测序法等。若要完成MTHFR和MTRR基因3个位点基因型的检测需要分别进行一个荧光PCR反应，在面对大规模样本检测时，无疑会耗费大量的人力物力，也会延长诊断时间；测序法则操作繁琐耗时且灵敏度低。因此，目前急需建立一种特异性好，灵敏性高的能够实现单一反应管中同时检测3个位点基因型的方法，以期能够更好、更快的用于MTHFR和MTRR基因3个位点基因型的检测。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种能够在单一反应管中同时检测MTHFR和MTRR基因3个位点基因型检测的试剂盒，该试剂盒具有特异性强、灵敏度高等优点。为了达到上述目的，本专利技术采用了以下的技术手段：本专利技术是一种人类MTHFR和MTRR基因检测试剂盒，其特征在于，包括以下各组分：MTHFR677/MTHFR1298/MTRR66三重检测液以及可选的以下组分：核酸扩增反应液、酶混合液、阳性对照和空白对照；其中，所述的MTHFR677/MTHFR1298/MTRR66三重检测液包括以下3组组分：组分(1)：由检测MTHFR基因677位点一对引物对和一条探针组成，其中，所述的引物对的碱基序列分别为SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示；所述探针的碱基序列如SEQIDNo.3所示，其中，SEQIDNo.3的5′端标记有荧光报告基团，3′端标记有荧光淬灭基团；组分(2)：由检测MTHFR基因1298位点一对引物对和一条探针组成，其中，所述的引物对的碱基序列分别为SEQIDNo.4和SEQIDNo.5所示；所述探针的碱基序列如SEQIDNo.6所示，其中，SEQIDNo.6的5′端标记有荧光报告基团，3′端标记有荧光淬灭基团；组分(3)：由检测MTRR基因66位点一对引物对和一条探针组成，其中，所述的引物对的碱基序列分别为SEQIDNo.7和SEQIDNo.8所示；所述探针的碱基序列如SEQIDNo.9所示，其中，SEQIDNo.9的5′端标记有荧光报告基团，3′端标记有荧光淬灭基团。其中，优选的，所述荧光报告基团选自FAM、VIC、ROX、Cy3或Cy5荧光报告基团，且组分(1)、组分(2)以及组分(3)选自不同的荧光报告基团；荧光淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1和Tamra中的任意一种或几种，但要求其能够淬灭标记在同一条探针上的荧光报告基团。本专利技术对上述引物和探针的配比比例进行了摸索和优化，试验结果发现，它们之间不同的配比比例对于检测结果的特异性和灵敏性具有显著的差异，本专利技术通过高通量的筛选试验发现，上述引物和探针在下述配比下，具有最优的检测效果：优选的，在本专利技术的一些实施方案中，组分(1)中引物及探针之间的配比为：SEQIDNo.1所示的引物:SEQIDNo.2所示的引物:SEQIDNo.3所示的探针＝400nM:400nM:200nM。优选的，在本专利技术的一些实施方案中，组分(2)中引物及探针之间的配比为：SEQIDNo.4所示的引物:SEQIDNo.5所示的引物:SEQIDNo.6所示的探针＝400nM:400nM:200nM。优选的，在本专利技术的一些实施方案中，组分(3)中引物及探针之间的配比为：SEQIDNo.7所示的引物：SEQIDNo.8所示的引物:SEQIDNo.9所示的探针＝400nM:400nM:200nM。优选的，在本专利技术的一些实施方案中，所述的核酸扩增反应液包括以下组分中的任意一种或多种的组合：PCR缓冲液、MgCl2、dATP、dTTP、dCTP、dGTP、dUTP、以及去RNA酶水。优选的，在本专利技术的一些实施方案中，所述的酶混合液包括以下组分中的任意一种或多种的组合：DNA聚合酶和UDG酶。DNA聚合酶在PCR扩增中起着非常重要的作用，为了达到更好的效果，更优选的，所述DNA聚合酶是化学修饰酶，所述UDG酶是E.coli尿嘧啶-DNA糖基化酶。优选的，在本专利技术的一些实施方案中，所述的阳性对照为所述的阳性对照为6种质粒DNA，所述6种质粒DNA分别为4种不同的MTHFR等位基因和2种不同的MTRR等位基因，所述的空白对照为去RNA酶水。优选的，在本专利技术的一些实施方案中，所述的检测试剂盒进行人类MTHFR和MTRR基因检测时，按照以下步骤进行：(1)采用核酸提取试剂盒提取样本的基因组DNA；(2)准备以下组分：核酸扩增反应液9μL，酶混合液1μL，MTHFR677/MTHFR1298/MTRR66三重检测液8μL，样本DAN2μL；(3)荧光PCR扩增及熔解曲线分析，按照以下程序进行：扩增(37℃5min；95℃15min；95℃10s，55℃40s，共进行45个循环)，然后进行熔解曲线分析(95℃10s，50-72℃0.03℃/s)；(4)结果判定：扩增结束后，根据熔解曲线判断样本的MTHFR和MTRR基因型；其中，优本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人类MTHFR和MTRR基因检测试剂盒，其特征在于，包括MTHFR 677/MTHFR 1298/MTRR 66三重检测液以及可选的以下组分：核酸扩增反应液、酶混合液、阳性对照和空白对照；其中，所述的MTHFR 677/MTHFR 1298/MTRR 66三重检测液包括以下3组组分：组分(1)：由检测MTHFR基因677位点一对引物对和一条探针组成，其中，所述的引物对的碱基序列分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示；所述探针的碱基序列如SEQ ID No.3所示，其中，SEQ ID No.3的5′端标记有荧光报告基团，3′端标记有荧光淬灭基团；组分(2)：由检测MTHFR基因1298位点一对引物对和一条探针组成，其中，所述的引物对的碱基序列分别为SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示；所述探针的碱基序列如SEQ ID No.6所示，其中，SEQ ID No.6的5′端标记有荧光报告基团，3′端标记有荧光淬灭基团；组分(3)：由检测MTRR基因66位点一对引物对和一条探针组成，其中，所述的引物对的碱基序列分别为SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示；所述探针的碱基序列如SEQ ID No.9所示，其中，SEQ ID No.9的5′端标记有荧光报告基团，3′端标记有荧光淬灭基团；其中，优选的，所述荧光报告基团选自FAM、VIC、ROX、Cy3或Cy5荧光报告基团，且组分(1)、组分(2)以及组分(3)选自不同的荧光报告基团；荧光淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1和Tamra中的任意一种或几种。...

【技术特征摘要】
1.一种人类MTHFR和MTRR基因检测试剂盒，其特征在于，包括MTHFR677/MTHFR1298/MTRR66三重检测液以及可选的以下组分：核酸扩增反应液、酶混合液、阳性对照和空白对照；其中，所述的MTHFR677/MTHFR1298/MTRR66三重检测液包括以下3组组分：组分(1)：由检测MTHFR基因677位点一对引物对和一条探针组成，其中，所述的引物对的碱基序列分别为SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示；所述探针的碱基序列如SEQIDNo.3所示，其中，SEQIDNo.3的5′端标记有荧光报告基团，3′端标记有荧光淬灭基团；组分(2)：由检测MTHFR基因1298位点一对引物对和一条探针组成，其中，所述的引物对的碱基序列分别为SEQIDNo.4和SEQIDNo.5所示；所述探针的碱基序列如SEQIDNo.6所示，其中，SEQIDNo.6的5′端标记有荧光报告基团，3′端标记有荧光淬灭基团；组分(3)：由检测MTRR基因66位点一对引物对和一条探针组成，其中，所述的引物对的碱基序列分别为SEQIDNo.7和SEQIDNo.8所示；所述探针的碱基序列如SEQIDNo.9所示，其中，SEQIDNo.9的5′端标记有荧光报告基团，3′端标记有荧光淬灭基团；其中，优选的，所述荧光报告基团选自FAM、VIC、ROX、Cy3或Cy5荧光报告基团，且组分(1)、组分(2)以及组分(3)选自不同的荧光报告基团；荧光淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1和Tamra中的任意一种或几种。2.按照权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于：组分(1)中引物及探针之间的配比为：SEQIDNo.1所示的引物:SEQIDNo.2所示的引物:SEQIDNo.3所示的探针＝400nM:400nM:200nM。3.按照权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于：组分(2)中引物及探针之间的配比为：SEQIDNo.4所示的引物:SEQIDNo.5所示的引物:SEQIDNo.6所示的探针＝400nM:400nM:200nM。4.按照权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于：组分(3)中引物及探针之间的配比为：SEQIDNo.7所示的引物：SEQIDNo.8所示的引物:SEQIDNo.9所示的探针＝400nM:400nM:200nM。5.按照权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述的核酸扩增反应液包括以下组分中的任意一种或多种的组合:PCR缓冲液、MgCl2、dATP、dTTP、dCTP、dGTP、dUTP、以及去RNA酶水。6.按照权利要求1所述的检测试剂盒，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：巫益鸣，胡艳民，徐加发，刘中华，王国强，
申请(专利权)人：江苏硕世生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32