一种快速构建链特异性RNA高通量测序文库的方法技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域，尤其涉及一种快速构建链特异性RNA高通量测序文库的方法。本发明专利技术中RNA建库完成仅需四步，即片段化，RT、PCR富集和文库纯化。与传统RNA文库构建方法相比，简化了操作流程，时间短，效率高，并且只需2种酶即可产生高质量的链特异性RNA‑seq文库。

A rapid method for constructing chain specific RNA high throughput sequencing Library

The invention belongs to the field of gene engineering technology, in particular to a method for rapidly constructing chain specific RNA high throughput sequencing library. In the invention, RNA is only completed by four steps, namely fragmentation, RT, PCR enrichment and library purification. Compared with the traditional RNA library construction method, the operation process is simplified, the time is short, and the efficiency is high, and the high quality chain specific RNA SEQ library can be produced by only 2 enzymes.

【技术实现步骤摘要】
一种快速构建链特异性RNA高通量测序文库的方法
本专利技术属于基因工程
，尤其涉及一种快速构建链特异性RNA高通量测序文库的方法。技术背景近年来，随着Illumina、Roche454、SOLiD等二代高通量测序仪的相继推出，测序费用大幅度下降，越来越多的研究者借助二代测序平台得到的大数据，进行更全面、更深入地分析基因组、转录组及蛋白质组之间的交互作用。RNA测序(RNA-seq)已成为生物学和医学不可或缺的工具，RNA序列信息作为机体基因在转录水平的表征，为疾病诊断分析和基因治疗等方法应用提供了重要支持。目前进行RNA测序需构建文库。以去完rRNA的RNA样品为例，传统的RNA文库构建流程如说明书附图图1所示，包括片段化、纯化、随机引物杂交，cDNA合成、第二条链合成、末端修复、纯化、磷酸化、加A、加接头、纯化、PCR富集和纯化，整个流程操作繁琐，所需试剂种类多，耗时长，致使物料和人力成本偏高，且需多次纯化，每步都有损耗，多步积累致使得率较低。且传统建库方法获得的测序文库无法区分正义链和反义链。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供一种快速构建链特异性RNA高通量测序文库的方法，目的是解决RNA测序建库过程中操作繁琐、物料和人力成本偏高的问题，同时解决RNA方向性问题，具有成本低，时间短，效率高且具有链特异性的优势。实现本专利技术目的快速构建链特异性RNA高通量测序文库的方法，按照以下步骤进行：(1)采用片段化试剂对RNA样本片段化；(2)在步骤(1)后直接加入逆转录引物、模板跳转引物以及逆转录试剂，实现由RNA逆转录成DNA并加上测序接头；(3)在步骤(2)后直接加入扩增体系，进行文库的放大；(4)在步骤(3)后直接加入磁珠对扩增后的文库进行纯化，纯化后的产物即为上机文库。所述的片段化试剂是RT-Buffer，包括：5～500mMTris-HClpH7.0～9.0，5～500mMNaCl，1～100mMDTT，0.1～50mMMgCl2。所述的RNA样本来源包括人类的全血、新鲜组织、石蜡包埋组织FFPE、口腔脱落细胞、细胞系、粪便、尿液、外泌体以及其它体液，其它动物物种、植物、细菌以及病毒。所述的RNA包括TotalRNA、lncRNA、mRNA、circRNA等。所述的RNA片段化温度为80℃-95℃。所述的RNA片段化时间为1分钟-60分钟。所述的逆转录引物5’端为测序引物序列，3’端为序列特异性引物序列，所述的特异性引物序列包括基因特异性引物、随机引物和多聚物寡核酸，其中基因特异性引物长度为15-60bp，随机引物长度为3-20bp，如：NNNNNN，N＝A或C或G或T，多聚物寡核酸长度为10-60bp，如：oligodT。所述的模板跳转引物5’端为测序引物序列，3’端为跳转序列，其中跳转序列为DNA或RNA或DNA/RNA混合链，长度为2-10bp，跳转序列的碱基需修饰，所述的修饰包括甲基化修饰、氨基化修饰、磷酸化修饰、硫代修饰、C3Spacer修饰。所述的逆转录试剂包括：5～500mMTris-HCl(pH7.0～9.0)、5～500mMNaCl、1～100mMDTT、0.1～50mMMgCl2、0.1～50mMdNTP。所述的上机文库适用于Roche、Illumina、ThermoFisher、PacificBiosciences、华大基因、OxfordNanoporeTechnologies、华因康、瀚海基因多家高通量测序平台。与现有技术相比，本专利技术的特点和有益效果是：本专利技术是一种通过巧妙设计接头和试剂来产生链特异性RNA-seq文库的新方法，本专利技术中RNA建库完成仅需四步，即片段化，RT、PCR富集和文库纯化。与传统RNA文库构建方法相比，简化了操作流程，时间短，效率高，并且只需2种酶产生高质量的链特异性RNA-seq文库。附图说明图1是现有技术中RNA文库构建原理图；图2是本专利技术RNA文库构建原理图；图3是本专利技术RNA文库构建流程图；图4是本专利技术实施例1中得到的RNA文库电泳图；图5是本专利技术实施例2中得到的RNA文库与传统方法构建文库的对比图；其中：1：链特异性RNA文库快速构建方法；2：传统RNA文库构建方法。具体实施方式下面以Illumina平台为例，结合实施例对本专利技术进一步说明。实施例1：参照图2-3，本实施例快速构建外泌体RNA文库的方法，按照以下步骤进行：(1)采用片段化试剂对RNA样本片段化；取4ml血浆按照exoRNeasySerum/PlasmaMaxiKit(77064，QIAGEN)说明书进行外泌体的分离以及RNA的提取；在PCR管中配制表1反应体系，热循环仪85℃处理6min，立即置冰上；表1片段化反应体系组分体积(μL)RNA13RT-Buffer41uMRT-HEX1总体积18RT-HEX核酸序列为：GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNNNN；(2)在步骤(1)后直接加入逆转录引物、模板跳转引物以及逆转录试剂，实现由RNA逆转录成DNA并加上测序接头；配制表2反应体系，混匀，室温放置10min，热循环仪中42℃反应90min；表2逆转录反应体系组分体积(μL)步骤(1)产物18RT-Buffer120mMDTT2TS-3G110mMdNTP3.5RNaseInhibitor0.5ReverseTranscriptase1总体积27TS-3G核酸序列：ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGGG；(3)在步骤(2)后直接加入扩增体系，进行文库的放大；按表3配制反应体系，按下面程序进行文库扩增。扩增完成后，取5μL扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，140V，25min。表3PCR进行文库放大反应体系组分体积(μL)上一步产物23Mix25TS-Index1TS-Primer11总体积50文库扩增程序：98℃45S；98℃15S，60℃30S，28个循环；72℃30S；72℃1min；4℃forever；TS-Index核酸序列：CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGGCCAGGTGACTGGAGTTC；TS-Primer1核酸序列：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACA；(4)步骤(3)反应结束后，用无核酶水将RT产物补足至50μL，加入40μLAMPureXPbeads，混匀并室温静置5min，反应管置于磁力架上，静置3-5min，弃上清；加200μL80％乙醇进行洗脱，重复2～3次，用20μL10mMTris-HCl进行洗脱，得到纯化后的产物即为上机文库。文库检测：1.电泳分析取2μL纯化后的产物按照Life说明书进行Qubit定量，取5μL进行2％琼脂糖凝胶，140V，25min；得到的电泳分析结果如图4所示，文库主带清楚且主要分布在400bp左右，条带亮度明亮，与预期结果一致。2.qPCR定量检测按照KAPALibraryQuantifcationKit(Kapabiosystems,CatNo.KK4854)说明书进行操作，使用RocheLightCycler480实时荧光定量PCR仪检测，参照试剂盒里的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种快速构建链特异性RNA高通量测序文库的方法，其特征在于按照以下步骤进行：(1)采用片段化试剂对RNA样本片段化；(2)在步骤(1)后直接加入逆转录引物、模板跳转引物以及逆转录试剂，实现由RNA逆转录成DNA并加上测序接头；(3)在步骤(2)后直接加入扩增体系，进行文库的放大；(4)在步骤(3)后直接加入磁珠对扩增后的文库进行纯化，纯化后的产物即为上机文库。

【技术特征摘要】
1.一种快速构建链特异性RNA高通量测序文库的方法，其特征在于按照以下步骤进行：(1)采用片段化试剂对RNA样本片段化；(2)在步骤(1)后直接加入逆转录引物、模板跳转引物以及逆转录试剂，实现由RNA逆转录成DNA并加上测序接头；(3)在步骤(2)后直接加入扩增体系，进行文库的放大；(4)在步骤(3)后直接加入磁珠对扩增后的文库进行纯化，纯化后的产物即为上机文库。2.根据权利要求1所述的一种快速构建链特异性RNA高通量测序文库的方法，其特征在于所述的片段化试剂是RT-Buffer，包括：5～500mMTris-HClpH7.0～9.0，5～500mMNaCl，1～100mMDTT，0.1～50mMMgCl2。3.根据权利要求1所述的一种快速构建链特异性RNA高通量测序文库的方法，其特征在于所述的RNA样本来源包括人类的全血、新鲜组织、石蜡包埋组织FFPE、口腔脱落细胞、细胞系、粪便、尿液、外泌体以及其它体液，其它动物物种、植物、细菌以及病毒。4.根据权利要求1所述的一种快速构建链特异性RNA高通量测序文库的方法，其特征在于所述的RNA包括TotalRNA、lncRNA、mRNA、circRNA等。5.根据权利要求1所述的一种快速构建链特异性RNA高通量测序文库的方法，其特征在于所述的RNA片段化温度为80℃-95℃。6.根据权利要求1所述的一种快速构建链特异性RNA高通量测序文库的方法，其特征在于所述的RNA片段化时间为1分钟-6...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐琼，沈欢，徐根明，潘艺，赵谦，
申请(专利权)人：湖南大地同年生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南,43