本发明专利技术涉及一种适用于百合体胚发生过程中miRNAs分析的完整RNA提取方法，解决了百合属植物miRNAs提取产率低，提取质量差的难题，本方法尤其适用于百合体胚发生过程中愈伤组织及体细胞胚组织的完整RNA提取；RNA提取重复性好。通过不同发育阶段的体胚组织的RNA提取比较，可见RNA的含量及纯度均呈现出数值稳定的特点，表明该方法的稳定性很好。
【技术实现步骤摘要】
适用于百合体胚组织miRNAs分析的RNA提取方法
本专利技术属于适用于球根花卉的完整RNA提取方法，尤其适用于百合属植物体胚发生过程中miRNAs分析的完整RNA提取。
技术介绍
miRNAs是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，长度约20～25个核苷酸，由miRNAs介导的基因调控机制在植物生长发育和适应各种外界环境胁迫过程中都起到了非常重要的作用。近年来miRNAs的功能解析逐渐成为生命科学研究领域的研究热点，因此在研究初始，如何获得高质量的miRNAs就显得尤为重要。不同植物种类、不同部位和不同发育时期的组织由于在细胞类型和细胞内含物上存在一些差异，所以在RNA的提取方法上常常需要进行相应地调整。对于植物组织的RNA提取应用的最为广泛的方法包括TRIzol法、CTAB法、SDS法，这些RNA提取方法的命名是基于RNA提取液中起裂解细胞和分离核酸与蛋白作用的主效成分。目前生物公司开发出来的标准化的RNA提取试剂盒也是基于上述几种方法的原理，特别之处是采用过柱法纯化RNA的工厂化产品。CTAB(十六烷基溴化三甲胺)是一种强离子变性去污剂，能够促使蛋白质从核酸中分离出来，最早是由Doyle等人使用，从大麦苗新鲜叶片中提取获得DNA，后被广泛用于从植物中获得高质量的核酸。植物组织中的多糖和多酚等杂质对RNA的分离和纯化有很大干扰。多糖的许多理化性质和RNA相似，在抽提过程中容易与RNA形成粘稠难溶的胶状物共沉淀，因此在去除多糖的同时也会随之携带走一部分RNA，造成RNA的大量损失，而对于本来含量就相对较低的miRNAs影响则更为严重。同样地，由于多糖类胶状物质会严重堵塞过滤柱，所以也无法利用试剂盒法来纯化RNA。另外，残留多糖溶解后对RNA样品造成污染，使RNA的纯度无法达到后续分子生物学实验的要求；而酚类化合物极易被氧化成多醌类物质而褐化，同时与RNA会发生不可逆的结合，从而导致RNA产量降低和活性丧失。由于CTAB可以沉淀多糖类物质，PVP(聚乙烯吡咯烷酮)可与多酚形成复合物并通过离心步骤去除，因此CTAB法成为富含多糖、多酚的植物组织提取RNA的优先选择方法。百合的愈伤组织及由其后续发育而来的体细胞胚组织中含有大量的淀粉、可溶性糖和可溶性蛋白等物质，用常规的RNA提取方法提取的RNA质量较低，降解严重，产率也很低，尤其对于包含miRNAs的5SRNA提取量很难达到后续实验分析要求。目前，对百合总RNA提取的成熟方法大多限于以叶片、花瓣组织为提取材料的报道，因此建立一种高效的适用于百合属植物愈伤组织和体细胞胚组织的完整RNA提取方法十分迫切。
技术实现思路
为了弥补上述现有技术的不足，本专利技术的目的是提出一种适用于百合体胚发生过程中miRNAs分析的完整RNA提取方法，解决了百合属植物miRNAs提取产率低，提取质量差的难题，本方法尤其适用于百合体胚发生过程中愈伤组织及体细胞胚组织的完整RNA提取。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的，包括以下步骤：(1)外源RNase的去除及溶液的配制在RNA提取之前将各种型号的枪头、不同容量的离心管、PCR管及枪头盒浸泡在1‰DEPC水中，25℃浸泡处理24小时，用保鲜袋密封后放入高压灭菌锅内，121℃加热40分钟，灭菌后置于80℃烘箱内烘干。RNA提取所需的丝口瓶、三角瓶、研钵、研杵、药匙等工具需在180℃烘箱内高温处理8小时。(2)RNA提取所用药品配制CTAB提取液(1000mL)：准确称取CTAB20g，PVP20g，NaCl81.816g，依次放入1000mL烧杯中，加入800mL超纯水，将烧杯置于磁力搅拌器上80℃助溶，1小时即可完全溶解。在上述溶解后的混合液中，加入12.114gTris，用38％浓HCl调pH值至8.0，然后再加入50.845gEDTA，并用固体NaOH调pH值至8.0。待溶液温度自然降至室温后转入1000mL的容量瓶中并用超纯水定容。最后将定容后的提取液转移到1000mL丝口瓶内，121℃灭菌20分钟。密封好的CTAB提取液置于4℃冰箱内备用。3mol/LNaAC(pH5.2，100mL)：准确称取无水NaAC24.609g溶解于80mL超纯水中，用乙酸(99.8％)调节pH值至5.2，再转入100mL容量瓶中定容。最后将配好的溶液转移到100mL丝口瓶内，121℃灭菌20分钟。密封好的3mol/LNaAC(pH5.2)置于4℃冰箱内备用。70％乙醇(100mL)：用100mL量筒量取70mL无水乙醇，倒入100mL丝口瓶中，再量取30mLDEPC水加入丝口瓶中，封好后置于-20℃冰箱里备用。(3)提取液预热取CTAB提取液5mL加入到50mL离心管内，再向其中加入10μL巯基乙醇，然后将离心管置于65℃水浴锅预热20分钟。(4)植物样品研磨先用液氮对研钵、研杵和药匙进行快速冷却，然后取1g百合胚性愈伤组织或体胚组织进行研磨，研磨过程中不断加入液氮以保证样品不软化。将样品磨至粉末状后转移至装有预热CTAB提取液的50mL离心管中，立即涡旋震荡混匀。(5)RNA释放将上述50mL离心管置于65℃水浴锅恒温加热20分钟，每隔5分钟取出涡旋震荡一次，最后一次涡旋震荡后将样品溶液分装到2mL无RNase的离心管中(每管900μL)，再依次加入等体积的水饱和酚(900μL，pH4.4)，1/5体积的3mol/LNaAC(160μL，pH5.2)，对以上得到的每管混合液均涡旋震荡4分钟。(6)去组织残渣、蛋白质向上述混合液中加入1/3体积的氯仿(300μL)，并充分混匀，12,000rpm离心8分钟；用移液枪小心将上清液(约800μL)转移到新的2mL无RNase离心管内，然后加入与上清液等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提液(800μL)，涡旋混匀，12,000rpm离心10分钟，将得到上清液继续用氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提液反复抽提3次，直至抽提混合液的中间相变得清亮。(7)收集RNA将上清液(约900μL)转入新的2mL无RNase离心管中，加入等体积的异丙醇(900μL)，轻柔地颠倒混匀后置于-80℃超低温冰箱中冷冻1小时。12,000rpm离心15分钟，弃上清，向管内加入-20℃预冷的1mL70％乙醇，轻微涡旋洗涤沉淀的RNA，再经8,000rpm离心5分钟，收集RNA。(8)RNA溶解保存离心后立即倒掉上清液体，将离心管敞口置于超净工作台内风干(10分钟)，取30μL超纯水溶解沉淀。(9)RNA纯化使用DNaseⅠ对所提总RNA中的DNA进行消化和纯化处理。(10)RNA质量检测采用1％琼脂糖凝胶电泳和200PRO(Tecan,Switzerland)酶标仪检测RNA质量，只有满足电泳条带清晰无拖尾，A260/A280比值在1.9-2.1之间，且A260/A230比值大于2.0的RNA才能用于后续cDNA的合成。本专利技术的优点和效果：(1)RNA完整性高，5SRNA提取产率高。用常规的CTAB法、TRIzol法和SDS法从百合愈伤组织和体胚中成功提取出的总RNA质量低，电泳条带均呈现出弥散状，即miRNAs提取产率仍然相对较低；(2)RNA提取质量高。采用改良后的CTAB法提取出总RNA的纯度较高，A本文档来自技高网...
【技术保护点】
适用于百合体胚组织miRNAs分析的RNA提取方法，其特征是：包括以下步骤：（1）外源RNase的去除及溶液的配制在RNA提取之前将各种型号的枪头、不同容量的离心管、PCR管及枪头盒浸泡在1‰ DEPC水中，25℃浸泡处理24小时，用保鲜袋密封后放入高压灭菌锅内，121℃加热40分钟，灭菌后置于80℃烘箱内烘干，RNA提取所需的丝口瓶、三角瓶、研钵、研杵、药匙等工具需在180℃烘箱内高温处理8小时；（2）RNA提取所用药品配制CTAB提取液 (1000 mL) ：准确称取CTAB 20 g，PVP 20 g，NaCl 81.816 g，依次放入1000 mL烧杯中，加入800 mL超纯水，将烧杯置于磁力搅拌器上80℃助溶，1小时即可完全溶解，在上述溶解后的混合液中，加入12.114 g Tris，用38%浓HCl调pH值至8.0，然后再加入50.845 g EDTA，并用固体NaOH调pH值至8.0，待溶液温度自然降至室温后转入1000 mL的容量瓶中并用超纯水定容；最后将定容后的提取液转移到1000 mL丝口瓶内，121℃灭菌20分钟，密封好的CTAB提取液置于4℃冰箱内备用；3 mol/L NaAC (pH5.2，100 mL) ：准确称取无水NaAC 24.609 g溶解于80 mL超纯水中，用乙酸 (99.8%) 调节pH值至5.2，再转入100 mL容量瓶中定容，最后将配好的溶液转移到100 mL丝口瓶内，121℃灭菌20分钟，密封好的3 mol/L NaAC (pH5.2) 置于4℃冰箱内备用；70%乙醇 (100 mL) ：用100 mL量筒量取70 mL无水乙醇，倒入100 mL丝口瓶中，再量取30 mL DEPC水加入丝口瓶中，封好后置于‑20℃冰箱里备用；氯仿∶异戊醇 (24∶1) 抽提液 (250 mL) ：用烘干处理后的500 mL量筒分别量取240 mL氯仿和10 mL异戊醇，于250 mL丝口瓶中混匀，置于4℃冰箱内备用；（3）提取液预热取CTAB提取液5 mL加入到50 mL离心管内，再向其中加入10μL巯基乙醇，然后将离心管置于65℃水浴锅预热20分钟；（4）植物样品研磨先用液氮对研钵、研杵和药匙进行快速冷却，然后取1 g百合胚性愈伤组织或体胚组织进行研磨，研磨过程中不断加入液氮以保证样品不软化，将样品磨至粉末状后转移至装有预热CTAB提取液的50 mL离心管中，立即涡旋震荡混匀；（5）RNA释放将上述50 mL离心管置于65℃水浴锅恒温加热20分钟，每隔5分钟取出涡旋震荡一次，最后一次涡旋震荡后将样品溶液分装到2 mL无RNase的离心管中 (每管900 μL)，再依次加入等体积的水饱和酚 (900μL，pH4.4)，1/5体积的3 mol/L NaAC (160μL，pH5.2)，对以上得到的每管混合液均涡旋震荡4分钟；（6）去组织残渣、蛋白质向上述混合液中加入1/3体积的氯仿 (300 μL)，并充分混匀，12,000 rpm离心8分钟；用移液枪小心将上清液 (约800 μL) 转移到新的2 mL无RNase离心管内，然后加入与上清液等体积的氯仿∶异戊醇 (24∶1) 抽提液 (800 μL)，涡旋混匀，12,000 rpm离心10分钟，将得到上清液继续用氯仿∶异戊醇 (24∶1) 抽提液反复抽提3次，直至抽提混合液的中间相变得清亮；（7）收集RNA将上清液 (约900 μL) 转入新的2 mL无RNase离心管中，加入等体积的异丙醇 (900 μL)，轻柔地颠倒混匀后置于‑80℃超低温冰箱中冷冻1小时，12,000 rpm离心15分钟，弃上清，向管内加入‑20℃预冷的1 mL70%乙醇，轻微涡旋洗涤沉淀的RNA，再经8,000 rpm离心5分钟，收集RNA；（8）RNA溶解保存离心后立即倒掉上清液体，将离心管敞口置于超净工作台内风干 (10分钟)，取30 µL超纯水溶解沉淀；（9）RNA纯化使用DNaseⅠ对所提总RNA中的DNA进行消化和纯化处理；（10）RNA质量检测A260/A280比值在1.9‑2.1之间，且A260/A230比值大于2.0的RNA才能用于后续cDNA的合成。...
【技术特征摘要】
1.适用于百合体胚组织miRNAs分析的RNA提取方法，其特征是：包括以下步骤：（1）外源RNase的去除及溶液的配制在RNA提取之前将各种型号的枪头、不同容量的离心管、PCR管及枪头盒浸泡在1‰DEPC水中，25℃浸泡处理24小时，用保鲜袋密封后放入高压灭菌锅内，121℃加热40分钟，灭菌后置于80℃烘箱内烘干，RNA提取所需的丝口瓶、三角瓶、研钵、研杵、药匙等工具需在180℃烘箱内高温处理8小时；（2）RNA提取所用药品配制CTAB提取液(1000mL)：准确称取CTAB20g，PVP20g，NaCl81.816g，依次放入1000mL烧杯中，加入800mL超纯水，将烧杯置于磁力搅拌器上80℃助溶，1小时即可完全溶解，在上述溶解后的混合液中，加入12.114gTris，用38%浓HCl调pH值至8.0，然后再加入50.845gEDTA，并用固体NaOH调pH值至8.0，待溶液温度自然降至室温后转入1000mL的容量瓶中并用超纯水定容；最后将定容后的提取液转移到1000mL丝口瓶内，121℃灭菌20分钟，密封好的CTAB提取液置于4℃冰箱内备用；3mol/LNaAC(pH5.2，100mL)：准确称取无水NaAC24.609g溶解于80mL超纯水中，用乙酸(99.8%)调节pH值至5.2，再转入100mL容量瓶中定容，最后将配好的溶液转移到100mL丝口瓶内，121℃灭菌20分钟，密封好的3mol/LNaAC(pH5.2)置于4℃冰箱内备用；70%乙醇(100mL)：用100mL量筒量取70mL无水乙醇，倒入100mL丝口瓶中，再量取30mLDEPC水加入丝口瓶中，封好后置于-20℃冰箱里备用；氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提液(250mL)：用烘干处理后的500mL量筒分别量取240mL氯仿和10mL异戊醇，于250mL丝口瓶中混匀，置于4℃冰箱内备用；（3）提取液预热取CTAB提取液5mL加入到50mL离心管内，再向其中加入1...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙红梅，张静，王春夏，王志平，
申请(专利权)人：沈阳农业大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21
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