一种外周血游离肿瘤DNA的富集方法、试剂盒及其应用技术

本申请公开了一种外周血游离肿瘤DNA的富集方法、试剂盒及其应用。本申请的富集方法，包括采用PAP探针对cfDNA文库进行肿瘤DNA片段捕获，并以PAP探针为引物，以捕获的肿瘤DNA片段为模板，进行扩增；PAP探针从5’端到3’端由通用引物序列和特异识别序列组成，特异识别序列3’端包括至少30bp的与肿瘤DNA片段杂交互补的序列，PAP探针3’末端为双脱氧核苷酸。本申请的富集方法，通过PAP探针对靶标肿瘤DNA片段进行捕获，并利用PAP探针进行延伸；特异性好，捕获效率高；保证了富集产物的纯度，为后续的测序提供了保障。本申请的富集方法，为cfDNA的临床检测提供了一种新的游离肿瘤DNA富集方案。

Enrichment method, kit and application of peripheral blood free tumor DNA

The present invention discloses a method for enriching peripheral blood free tumor DNA, a kit and its application. The enrichment method of this application includes the use of the PAP probe to capture the tumor DNA fragment of the cfDNA library and the primers of the PAP probe as the template for the captured tumor DNA fragment. The PAP probe is composed of the universal primer sequence and the specific recognition sequence from the 5 'end to the 3' end, and the specific recognition sequence 3 'end includes at least 30bp. The 3 'terminal of PAP probe is a deoxyribonucleotide, which is complementary to the tumor DNA fragment. The enrichment method of this application is used to capture the target tumor DNA fragments through the PAP probe and extend with the PAP probe. The specificity is good, the capture efficiency is high, the purity of the enriched product is ensured, and the subsequent sequencing is guaranteed. The enrichment method of this application provides a new DNA enrichment scheme for clinical detection of cfDNA.

【技术实现步骤摘要】
一种外周血游离肿瘤DNA的富集方法、试剂盒及其应用
本申请涉及肿瘤检测领域，特别是涉及一种外周血游离肿瘤DNA的富集方法、试剂盒及其应用。
技术介绍
恶性肿瘤的发生是一个多基因多事件积累的结果。在肿瘤克隆性演化的过程中，常积累一系列的基因突变，可能涉及不同染色体上多种基因的变化，如癌基因、抑癌基因、细胞凋亡基因、细胞周期调节基因及维持细胞基因组稳定性的基因等。通过高通量测序技术可研究上述基因及其表达mRNA的突变和表达水平的变化，从而揭示肿瘤发生和演化中信号和代谢通路的变化。肿瘤机制的认识和科学技术的发展进一步促进肿瘤治疗理念的转变，个体化的靶向药物治疗模式在临床肿瘤治疗中占据越来越重要的地位。2015年1月底，奥巴马提出精准医疗计划，致力于治愈癌症和糖尿病等疾病。2016年1月，继精准医疗计划后，奥巴马进一步提出了癌症登月计划。2016年3月8日，中国卫计委正式发布《科技部关于发布国家重点研发计划精准医学研究等重点专项2016年度项目申报指南的通知》(简称“国家指南”)，拉开了精准医疗重大专项科研行动的序幕。国家指南明确指出，精准医疗将是优先启动的重点专项之一，并正式进入实施阶段。目前，精准医疗更多的集中在肿瘤的早期诊断及治疗领域，基于肿瘤基因检测的个体化治疗成为癌症治疗的重要发展趋势之一。目前，针对高发病率的肺癌、胃癌、食道癌、结直肠癌、乳腺癌等癌症，全世界已经开发出多款相应的抗肿瘤药物用于临床治疗。然而，临床用药数据统计结果表明，即使是使用了相应抗肿瘤药物的癌症患者，其预后效果却不尽如人意；这引起了临床医生、学者以科学家们进行了大量的研究和探索发现，目前已经上市的抗肿瘤药物疗效具有个体差异性，特别是在癌症患者的基因组研究方面，发现患者对药物是否敏感与其癌细胞的基因组突变直接相关。癌症患者一旦在部分药物靶向基因区段发生突变，可能会导致长期服用昂贵的抗肿瘤药物而病情却无法缓解的情况。也有研究结果表明，一些在药靶基因区段发生突变的癌症患者，对于相应药物的敏感性增强，而且有更好的预后。这提示，如果对癌症患者的药物靶向基因在其用药前期进行检测，获取其基因突变的具体情况，就可以大致预测患者使用相应抗肿瘤药物的疗效。然而，对于单个药物靶点的检测，有时候并不能很好的预测药物的疗效，高通量测序技术的发展使得检测所有靶向药物的所有靶点基因成为可能，其检测结果可指导制定最佳肿瘤治疗方案。近期Science上发表了一篇利用基因组测序方法阐明Everolimus(依维莫司)治疗膀胱癌作用机制的研究，进一步证明了高通量测序在肿瘤治疗中实行个性化的重要性。华盛顿大学基因组研究所对一位患有白血病的患者进行全基因组和转录组测序，最终找到了导致其癌症细胞快速繁衍的“元凶”，一个名为FLT3的基因并恰好找到一种肾癌药物能够起效。近年来基于高通量的肿瘤个体化治疗已成为科学发现和临床转化的热点。高通量测序技术的发展使得癌症基因组测序成为可能。通过对患病组织多基因、多位点大规模并行测序，不仅可以一次性筛选各类靶药位点，提供精准治疗方案，更能明确癌症病因，实现个体化医疗。近年来的一些研究显示，肿瘤病人血浆或血清中DNA的遗传变异与正常人存在较显著差异，有望成为一种有效的肿瘤治疗和监测手段。DennisLo近期在Clinchem上发表相关研究，在该研究中对4名肝癌患者和1名乳腺癌和卵巢癌并发患者的外周血浆DNA进行全基因组测序，进一步证明了利用癌症患者外周血浆DNA结合新一代高通量测序技术在癌症个体化治疗上的可行性。RebeccaJ.Leary等在7名晚期结肠癌和3名乳腺癌患者中也进一步证实在血浆中检测来自肿瘤细胞的拷贝数变异和结构性变异的可行性，以及临床应用的前景。利用外周血游离肿瘤DNA(缩写ctDNA)进行肺癌多靶点基因的检测可解决目前临床面临的两大问题：(1)原发肿瘤反复，组织活检无论在伦理还是实际操作上均有一定难度，并且可能延误治疗和导致并发症的产生；(2)单点活检只能代表选择部位肿瘤的病理情况，而ctDNA可代表多个病灶的整体基因信息。基于高通量多基因测序平台的肿瘤无创检测是目前全球肿瘤研究的热门领域。但是，ctDNA在外周血游离DNA中的含量极低，特别是在癌症早期，ctDNA的含量微乎其微，因此，需要对目标基因进行富集后才能达到基因测序平台的检测需求。现有的目标区域富集技术有以下4类：(1)常规建库后芯片杂交捕获富集，如罗氏公司Nimblegen系列芯片；(2)直接多重PCR富集目标区域，如ThermoFisher公司的Ampliseq系列产品；(3)组合DNA文库构建和多重PCR，如AnchorDx；(4)环化PCR方法，如贝瑞和康公司的cSMART。以上4类目标区域富集方法，其中，基于探针杂交的富集方法存在实验周期长、捕获效率低、成本高等缺点。多重PCR、环化PCR的方法对于基因融合(fusion)变异不支持或支持力度低。同向一段探针延伸捕获可以支持基因融合变异，但存在捕获时间长、捕获效率依旧不够或高成本等缺点，导致交付时间延长，有效数据损失以及产品成本过高。上述缺陷，限制了传统目标区域富集方法在临床检测，特别是液体活检领域的应用。故需要开发一种成本低、交付周期短、样本分子利用率高、能够兼容基因融合检测和低频SNV检测的新技术应用于临床检测。
技术实现思路
本申请的目的是提供一种新的外周血游离肿瘤DNA的富集方法、试剂盒及其应用。本申请采用了以下技术方案：本申请的一方面公开了一种外周血游离肿瘤DNA的富集方法，包括采用PAP探针对cfDNA文库进行肿瘤DNA片段捕获，并以PAP探针为引物，以捕获的肿瘤DNA片段为模板，对捕获的肿瘤DNA片段进行扩增，实现肿瘤DNA的富集；其中，PAP探针从5’端到3’端依序由通用引物序列和特异识别序列两部分组成，特异识别序列的3’端包括至少30bp的与所述肿瘤DNA片段特异性杂交的互补序列，并且，PAP探针的3’末端最后一位碱基为与肿瘤DNA片段特异性杂交互补的双脱氧核苷酸。需要说明的是，本申请的外周血游离肿瘤DNA的富集方法，创造性的将PAP探针用于外周血游离肿瘤DNA的杂交捕获，并将PAP探针作为引物，对其捕获的肿瘤DNA片段进行扩增，其优点在于：(1)PAP探针的杂交捕获功能，PAP探针通过碱基互补特异的与目标区域进行结合，能够对肿瘤DNA片段进行特异性的捕获；(2)PAP探针作为引物，对于正确配对的探针可以进行焦磷酸解激活并延伸，对于错配的探针则不延伸，进一步确保了特异性；(3)正确形成测序文库功能，对于杂交且延伸的序列，探针提供测序所需要的通用引物序列，即PAP探针5’端的通用引物序列，而体系中残留的非目标序列文库则不含有此段通用序列，确保了用于测序序列的纯度。以上(1)和(2)两点大大提升了捕获效率，并极大的缩短了捕获时间。优选的，本申请的富集方法还包括采用通用引物对PAP探针的扩增产物进行第二次扩增，进一步对肿瘤DNA片段进行富集；其中，通用引物包括PAP探针通用引物和cfDNA文库通用引物；PAP探针通用引物为针对PAP探针的通用引物序列设计的引物；cfDNA文库通用引物为cfDNA文库建库时从接头中引入的通用引物。需要说明的是，第二次扩增实际上是对延伸的PAP探针本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种外周血游离肿瘤DNA的富集方法，其特征在于：包括采用PAP探针对cfDNA文库进行肿瘤DNA片段捕获，并以PAP探针为引物，以捕获的肿瘤DNA片段为模板，对捕获的肿瘤DNA片段进行扩增，实现肿瘤DNA的富集；所述PAP探针从5’端到3’端依序由通用引物序列和特异识别序列两部分组成，所述特异识别序列的3’端包括至少30bp的与所述肿瘤DNA片段特异性杂交的互补序列，并且，所述PAP探针的3’末端最后一位碱基为与所述肿瘤DNA片段特异性杂交互补的双脱氧核苷酸。

【技术特征摘要】
1.一种外周血游离肿瘤DNA的富集方法，其特征在于：包括采用PAP探针对cfDNA文库进行肿瘤DNA片段捕获，并以PAP探针为引物，以捕获的肿瘤DNA片段为模板，对捕获的肿瘤DNA片段进行扩增，实现肿瘤DNA的富集；所述PAP探针从5’端到3’端依序由通用引物序列和特异识别序列两部分组成，所述特异识别序列的3’端包括至少30bp的与所述肿瘤DNA片段特异性杂交的互补序列，并且，所述PAP探针的3’末端最后一位碱基为与所述肿瘤DNA片段特异性杂交互补的双脱氧核苷酸。2.根据权利要求1所述的富集方法，其特征在于：还包括采用通用引物对所述PAP探针的扩增产物进行第二次扩增，进一步对肿瘤DNA片段进行富集；所述通用引物包括PAP探针通用引物和cfDNA文库通用引物；所述PAP探针通用引物为针对PAP探针的通用引物序列设计的引物；所述cfDNA文库通用引物为cfDNA文库建库时添加接头引入的通用引物。3.根据权利要求2所述的富集方法，其特征在于：具体包括以下步骤，(1)将所述PAP探针加入到cfDNA文库中，利用PAP探针对肿瘤DNA片段进行杂交捕获；(2)采用磁珠纯化PAP探针的杂交捕获产物；(3)利用焦磷酸解激活聚合酶反应，对步骤(2)的磁珠纯化产物进行扩增，其中，在焦磷酸解激活聚合酶的作用下，以所述PAP探针为引物，对杂交捕获的肿瘤DNA片段进行特异性扩增；(4)采用磁珠纯化PAP探针的扩增产物；(5)采用外切酶I对步骤(4)纯化的PAP探针扩增产物进行酶切处理；(6)对步骤(5)的酶切产物进行磁珠纯化；(7)采用所述通用引物对步骤(6)纯化的酶切产物进行扩增，获得富集的肿瘤DNA片段。4.根据权利要求2或3所述的富集方法，其特征在于：所述cfDNA文库通用引物为Seq...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋炎，刘磊，叶明芝，王晶晶，刘继龙，谭美华，茅矛，
申请(专利权)人：深圳华大基因股份有限公司，广州华大基因医学检验所有限公司，天津华大医学检验所有限公司，华大生物科技武汉有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44