一种目标区域多重PCR与快速文库构建的方法技术

本发明专利技术属于遗传学与精准医学领域，涉及到一种靶向特异区段超高重PCR与快速文库构建的新方法。本发明专利技术能在2‑3小时内,由2.5‑50ng经提取的DNA为模板获得符合下游分析要求的高质量文库，并且在建库过程中引物端自动加上样本区分barcode，无需二次建库。下机数据各扩增子均一性高，1M Reads前提下，99.5％扩增子上的热点达到1200X覆盖；特异性高，100％的靶序列均能被有效扩增。本发明专利技术文库接头的添加具有方向性，可提高数据利用率和文库质量。

【技术实现步骤摘要】
一种目标区域多重PCR与快速文库构建的方法
本专利技术属于遗传学与精准医学领域，涉及到一种靶向特异区段超高重PCR与快速文库构建的新方法。
技术介绍
多重PCR技术在遗传学与精准医学领域最大的价值在于它能提高诊断的敏感性。敏感性可以从两方面分析：检测敏感性和临床敏感性。检测敏感性强调的是检测结果：如果标本中含有被检测物，检测成功的几率是多少。如果是PCR反应，就是能检测到的最低拷贝数。临床敏感性是从临床角度看问题：实验结果给病人出诊断的成功率有多高。如果一个病仅有一个病因，检测敏感性和临床敏感性无差别。如果疾病的诊断需要同时分析多病因，仅对一个指标进行检测，检测敏感性再高其临床敏感性也要大打折扣。qPCR的检测敏感性是无可争议的，可是因为无法做多重，所以临床敏感性不够好。而多重PCR临床敏感性要高很多。精准医学时代，靶向特异区段重测序的需求日益增加，样本量常达上千，只用传统的Sanger法或目标区域杂交捕获测序价格昂贵。因此基于多重或超高重PCR的扩增子测序适用性强，可以针对连续区段，外显子靶标以其他指定位点，设计特异引物，一次获得所有位点，有着重要的临床意义和广泛的应用前景，但是仍然存在很多限制性因素，其中多重PCR扩增效率的一致性一直是最大的难题，扩增子越多、不均一性越高等。本领域需要解决多重PCR扩增效率的一致性。
技术实现思路
本专利技术旨在通过多重PCR快速构建DNA文库并解决其中多重PCR扩增效率的一致性问题。具体地：本专利技术提供一种通过多重PCR扩增DNA并构建文库的方法，包括：(1)获取样本DNA(2)使用添加了锚定接头且经过修饰的特异性引物对的集合，对步骤(1)得到的样本DNA进行第一轮PCR，所述特殊接头为且经过修饰的特异性引物对具有如下结构:5’修饰的锚定接头序列+针对待扩增区域的特异性序列(3)不添加新的引物，将步骤(2)得到的产物在新的反应体系中进行第二轮PCR，使得全部引物被用于扩增，(4)使用特殊设计的文库构建引物对，以所述特异性引物对上的特殊接头为引物锚定区域，进行扩增的同时在包含目标基因/区段的扩增子两端加上文库接头，所述文库构建引物对包含的引物具有如下结构(5’到3’)5’修饰的文库接头+锚定接头序列(5)构建文库。在一个实施方案中，所述特异性引物对的集合包括50-2000个引物对。在一个实施方案中，所述待扩增区域的特异性序列的长度为5-20kb个碱基。在一个实施方案中，步骤(2)所述的5’修饰是NH2-C6修饰。在一个实施方案中，步骤(2)中正向引物的锚定接头序列为：5’-NH2-C6-GCTCTTCCGATCTMM(SEQIDNO:1)，M为A或C；步骤(2)中反向引物的锚定接头序列为：5’-NH2-C6-GCTCTTCCGATCTKK(SEQIDNO:2)，M为G或T。在一个实施方案中，步骤(4)所述的5’修饰是NH2-C6修饰。在一个实施方案中，其中所述文库构建引物的引物之一还包括索引(index)序列，所述索引序列为4-10个任意碱基，作为区分文库的标签。在一个优选实施方案中，步骤(4)中正向引物的文库接头为：5’NH2-C6-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGAC(SEQIDNO:3)反向引物的文库接头为：5’NH2-C6-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGT(SEQIDNO:4)，其中N为任意碱基。在一个优选实施方案中，步骤(4)中正向引物(即文库构建正向引物)为：5’NH2-C6-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTMM(SEQIDNO:5)反向引物为(即文库构建反向引物)：5’NH2-C6-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTKK(SEQIDNO:6)其中M为A或C，K为G或T，NNNNNN为索引序列，N为任意碱基。在一个示例中，第一轮PCR中添加了锚定接头且经过修饰的特异性正向引物为:5’NH2-C6-GCTCTTCCGATCTMMx......x(x......x代表特异性区域)；添加了锚定接头且经过修饰的特异性反向引物为:5’NH2-C6-GCTCTTCCGATCTKKx......x(x......x代表特异性区域)；第二轮PCR不添加引物。第三轮PCR所用的文库构建正向引物为:5’NH2-C6-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTMM；文库构建反向引物为:5’NH2-C6-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTKK(NNNNNN为索引序列，N为任意碱基)；通过上述三轮PCR所获得的文库结构为：5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT[MMx......xMM]AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACNNNNNNATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’。有益效果：本专利技术能在2-3小时内,由2.5-50ng经提取的DNA快速构建文库。具体地，以添加了不同特殊接头且经过修饰的多个特异性正反向引物对，对DNA上的目标靶点进行第一轮扩增。为了保证各个目标区域被均等的扩增出来，我们将第一轮PCR产物投入到新的反应体系中，但不加入新的引物，以图引物被完全消耗从而保证各个目标区域扩增的均一性。在第三轮PCR中，以特异性正反向引物对上的特殊接头为引物锚定区域，进行扩增的同时在包含目标基因/区段的扩增子两端加上Illumina文库接头，以获得符合下游分析要求的高质量文库，并且在建库过程中引物端自动加上样本区分barcode，无需二次建库。下机数据各扩增子均一性高，1MReads前提下，99.5％扩增子上的热点达到1200X覆盖；特异性高，100％的靶序列均能被有效扩增。本专利技术文库接头的添加具有方向性，可提高数据利用率和文库质量。附图说明图1是用Agilent2100Bioanalyzer检测制备DNA文库中的片段长度分布范围的结果。L：DNALadder；S：使用20ngcfDNA构建的多重PCR产物文库，磁珠进行选择回收后结果。图2是用Agilent2100Bioanalyzer检测制备DNA文库中的片段长度分布范围的结果。图3是采用Samtools软件分析测序结果得到的位点测序覆盖深度数据，将各位点的深度做Log运算，然后将位点名称和深度的Log值反应在柱状图中，得到位点覆盖均一性数据(模板为CellFreeDNA,cfDNA)，其中横坐标为位点所在的基因名称和Cosmic数据库查询编号，纵坐标为测序覆盖深度数据的Log值，显示热点最大碱基覆盖度:93470X，最小覆盖度:256X。具体实施方式为更进一步阐述本专利技术所采取的技术手段及其效果，以下通过具体实施例来进一步说明本专利技术的技术本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种通过多重PCR扩增DNA并构建文库的方法，包括：(1)获取样本DNA(2)使用添加了锚定接头且经过修饰的特异性引物对的集合，对步骤(1)得到的样本DNA进行第一轮PCR，所述添加了锚定接头且经过修饰的特异性引物对具有如下结构:5’修饰的锚定接头序列+针对待扩增区域的特异性序列(3)不添加新的引物，将步骤(2)得到的产物在新的反应体系中进行第二轮PCR，使得全部引物被用于扩增，(4)使用特殊设计的文库构建引物对，以所述特异性引物对上的特殊接头为引物锚定区域，进行扩增的同时在包含目标基因/区段的扩增子两端加上文库接头，所述文库构建引物对包含的引物具有如下结构(5’到3’)5’修饰的文库接头+锚定接头序列(5)构建文库。

【技术特征摘要】
1.一种通过多重PCR扩增DNA并构建文库的方法，包括：(1)获取样本DNA(2)使用添加了锚定接头且经过修饰的特异性引物对的集合，对步骤(1)得到的样本DNA进行第一轮PCR，所述添加了锚定接头且经过修饰的特异性引物对具有如下结构:5’修饰的锚定接头序列+针对待扩增区域的特异性序列(3)不添加新的引物，将步骤(2)得到的产物在新的反应体系中进行第二轮PCR，使得全部引物被用于扩增，(4)使用特殊设计的文库构建引物对，以所述特异性引物对上的特殊接头为引物锚定区域，进行扩增的同时在包含目标基因/区段的扩增子两端加上文库接头，所述文库构建引物对包含的引物具有如下结构(5’到3’)5’修饰的文库接头+锚定接头序列(5)构建文库。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述特异性引物对的集合包括20-2000个引物对。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述待扩增区域的长度为5-20kb碱基，引物中错包括的特异性序列的长度为10-40bp。4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其中步骤(2)所述的5’修饰选自C18碳骨架、C6碳骨架、NH2-C6、NH2-C12、生物素、Biotin-TEG和Dualbiotin修饰。5.根据权利要求4所述的方法，其中所述5’修饰是NH2-C6修饰。6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其中步骤(2)中正向引物的锚定接头序列为5’-NH2-C6-GCTCTTCCGATCTM...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡春旭，陆思嘉，任军，
申请(专利权)人：序康医疗科技苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32