【技术实现步骤摘要】
大片段DNA环化连接方法
[0001]本专利技术属于基因工程领域,更具体地涉及一种大片段DNA环化连接方法及其在测序文库构建中的应用,和用于实现所述方法和应用的环化接头和试剂盒和由此形成的DNA分子和测序文库。
技术介绍
[0002]二代测序中,大片段文库构建是一种重要且基础的实验技术。对基因组序列未知或没有近源物种基因组信息的物种,采用二代测序进行基因图谱绘制是快速了解一个物种的途径之一。此外,二代测序也在目前人类基因组染色体结构变异的筛查检测过程中具有重要的使用价值。
[0003]末端配对测序(Mate
‑
Pair sequencing,MP测序)是目前最为常用的二代测序技术之一。该测序技术仅对DNA片段的两端进行成对测序,获得末端配对读段(Mate
‑
pair, MP)测序结果。该测序结果不仅提供读段本身的序列信息还提供配对的两末端中间的距离信息,由此可以判断测出的成对MP序列在基因组上的距离。
[0004]末端配对测序的实现,依赖于大片段的末端配对文库(mate
‑
pair library)的构建。在该文库构建过程中,通常的方法有两大类: 物理打断法或普通酶切法;和转座酶切打断法。
[0005]物理打断法或普通酶切法一般涉及:1)通过物理方法(DNA片段化仪)或普通酶切法打断gDNA并回收目的大小DNA片段;2)对回收的DNA片段两端加上通用的生物素标记接头;3)将带有生物素标记接头的DNA大片段进行环化;4)消化未环化的线性DNA ...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种环化接头,其特征在于,所述环化接头由5'磷酸化的寡核苷酸长链和与其互补的5'磷酸化的寡核苷酸短链组成,其中,所述寡核苷酸长链的5'端第一个碱基为A碱基,第二个碱基为U碱基,且其中,所述环化接头,按照寡核苷酸长链的5'至3'方向,具有如下结构:粘性末端生成区
‑
辅助序列区
‑
内部连接区,其中,粘性末端生成区由寡核苷酸长链5'最末端的AU二核苷酸组成,或由该二核苷酸和所述寡核苷酸短链上与其反向互补的二核苷酸AT组成,其中,内部连接区为用于所述环化接头与靶核酸连接的10至30bp长的双链或至少部分双链的寡核苷酸,其中,辅助序列区为0bp,或为10bp至75bp长的单链或双链或部分双链的寡核苷酸。2.如权利要求1所述的环化接头,其特征在于,所述环化接头包含由所述寡核苷酸短链与所述寡核苷酸长链的一部分互补形成的至少19bp长的双链体区,且所述环化接头具有21bp至50bp长。3.如权利要求1所述的环化接头,其特征在于,所述内部连接区由转座元件的双链寡核苷酸组成。4.如权利要求3所述的环化接头,其特征在于,所述环化接头,按照寡核苷酸长链的5'至3'方向,为具有5'突出端和3'平末端的双链寡核苷酸,且其中所述寡核苷酸长链从5'到3'方向由AU二核苷酸和转座元件的转移链组成;且所述寡核苷酸短链从5'到3'方向由转座元件的非转移链组成。5.如权利要求4所述的环化接头,其特征在于,所述转座元件的转移链具有SEQ ID NO:3所示的序列,且所述转座元件的非转移链具有SEQ ID NO:4所示的序列。6.如权利要求1所述的环化接头,其特征在于,所述寡核苷酸长链具有SEQ ID NO: 1的序列;且所述寡核苷酸短链具有SEQ ID NO: 2的序列。7.如权利要求1所述的环化接头,其特征在于,所述寡核苷酸长链具有SEQ ID NO: 5的生物素化序列;且所述寡核苷酸短链具有SEQ ID NO: 2的序列。8.如权利要求1所述的环化接头,其特征在于,所述内部连接区包含3'T突出端。9.如权利要求8所述的环化接头,其特征在于,所述环化接头,按照寡核苷酸长链的5'至3'方向,为具有5'平末端和3'突出端的双链寡核苷酸,其中所述5'平末端具有如下二核苷酸对:5'
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A U
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3'3'
‑ꢀ
T A
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5' ,且其中所述3'突出端为单碱基3'T突出端。10.如权利要求1所述的环化接头,其特征在于,所述辅助序列区包含选自如下的序列:索引序列,锚定位点、报告标签、条形码序列,和引物结合位点。11.如权利要求1所述的环化接头,其特征在于,所述环化接头具有缀合的生物素标记物。12.一种DNA环化连接方法,其特征在于,所述方法包括如下步骤:(i) 在靶DNA片段的两端加上根据权利要求1所述的环化接头,以得到带有环化接头的靶DNA片段,其中,所述得到的带有环化接头的靶DNA片段具有以反向末端重复的形式存在于其两
末端的如下二核苷酸对:5'
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A U
ꢀ‑
3'3'
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【专利技术属性】
技术研发人员:任军,高芳芳,张鹏,
申请(专利权)人:序康医疗科技苏州有限公司,
类型:发明
国别省市:
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