大片段DNA环化连接方法技术

本发明专利技术属于基因工程领域，更具体地涉及一种大片段DNA环化连接方法及其在测序文库构建中的应用，和用于实现所述方法和应用的试剂盒和由此形成的环化DNA分子和测序文库。和由此形成的环化DNA分子和测序文库。

【技术实现步骤摘要】
大片段DNA环化连接方法


[0001]本专利技术属于基因工程领域，更具体地涉及一种大片段DNA环化连接方法及其在测序文库构建中的应用，和用于实现所述方法和应用的试剂盒和由此形成的环化DNA分子和测序文库。

技术介绍

[0002]二代测序中，大片段文库构建是一种重要且基础的实验技术。对基因组序列未知或没有近源物种基因组信息的物种，采用二代测序进行基因图谱绘制是快速了解一个物种的途径之一。此外，二代测序也在目前人类基因组染色体结构变异的筛查检测过程中具有重要的使用价值。
[0003]末端配对测序(Mate
‑
Pair sequencing，MP测序)是目前最为常用的二代测序技术之一。该测序技术仅对DNA片段的两端进行成对测序，获得末端配对读段(Mate
‑
pair,MP)测序结果。该测序结果不仅提供读段本身的序列信息还提供配对的两末端中间的距离信息，由此可以判断测出的成对MP序列在基因组上的距离。
[0004]末端配对测序的实现，依赖于大片段的末端配对文库(mate
‑
pair library)的构建。在该文库构建过程中，通常的方法有两大类：物理打断法或普通酶切法；和转座酶切打断法。
[0005]物理打断法或普通酶切法一般涉及：1)通过物理方法(DNA片段化仪)或普通酶切法打断gDNA并回收目的大小DNA片段；2)对回收的DNA片段两端加上通用的生物素标记接头；3)将带有生物素标记接头的DNA大片段进行环化；4)消化未环化的线性DNA片段；5)将环化的DNA片段进行片段化，并采用链霉亲和素磁珠捕获带有生物素标记的DNA片段；6)将捕获的DNA片段进行扩增，建成测序用的DNA文库。
[0006]转座酶切打断法一般涉及：1)通过转座酶将gDNA片段化并加上生物素标记接头；2)回收目的大小的DNA片段并末端补齐；3)将带有生物素标记接头的DNA大片段进行环化；4)消化未环化的DNA片段；5)将环化的DNA片段进行片段化，并采用链霉亲和素磁珠捕获带有生物素标记的DNA片段；6)将捕获的DNA片段进行扩增，建成测序用的DNA文库。
[0007]在两种末端配对文库构建方法中，大片段DNA的环化连接都是文库构建的主要部分，其连接效率是限制大片段文库构建的关键节点。而且，由于末端配对测序有效数据来源于末端配对的DNA片段，因此DNA片段环化连接效率也影响了末端配对测序的整体效率。
[0008]目前基于分子内的环化连接主要有两种方式：一种是平末端直接连接方案；一种是采用重组酶系统对DNA大片段进行环化。平末端直接连接方案只能依靠大片段DNA分子自身扭曲的碰撞几率，因此环化效率较低，通常低于10％。基于重组酶系统对DNA大片段进行环化，也存在一些问题，例如，会产生大量比例的两端带有不同方向的重组位点的接头片段，导致重组无法进行；此外，重组酶系统在体外的重组效率不高，这些因素导致了整个系统的环化效率不超过10％。
[0009]为了提高DNA连接效率，较常见的研究集中在对建库过程中各种功能酶与缓冲液
的优化。例如，有研究者提出，通过优化连接缓冲液体系，通过添加高聚物聚乙二醇(PEG)，小分子丙二醇，甘油等试剂以实现高效率连接。这些研究虽也可有效提高连接效率，但或需复杂且高标准的设备生产改造酶，或因专利保护无法使用，或需花费较高的价格购买商品化试剂。
[0010]因此，迫切需要开发一种简便的方法，用以提升大片段DNA环化连接的效率。

技术实现思路

[0011]在分子间的连接上，粘性末端连接被认为是比平末端连接更为有效的DNA连接方式。在采用粘性末端连接两DNA分子时，一般认为，DNA连接效率受粘性末端的GC含量和粘性末端长度的影响。粘性末端的GC丰度高将有助于改善连接效率；并且对于含有A,G,T,C核苷酸的粘性末端，相对于较短的粘性末端，使用较长的粘性末端是更加有利的。而粘性末端富含A和T将显著降低连接效率。参见例如,GURNEET BOLA,2005，Evaluating the Role of G,C
‑
nucleotides and Length of Overhangs in T4 DNA Ligase Efficiency,Vol.8:1
‑
7,December 2005,M&I,UBC；和Tina Gao等,Increasing Overhang GC
‑
Content Increases Sticky
‑
End Ligation Efficiency，Journal of Experimental Microbiology and Immunology(JEMI),April 2015,M&I UBC。
[0012]然而，在对大片段DNA环化进行深入研究后，本专利技术人令人惊奇地发现，对于采用USER酶形成粘性末端来实现大片段DNA的分子内环化而言，引入仅2bp的AT粘性末端，是更为有效的环化连接方式。基于此令人惊奇的发现，本专利技术人完成了本专利技术。如本文实施例所证实，在大片段DNA的环化连接中，应用本专利技术的接头引入优化粘性末端，可以提高连接效率和目的连接产物占比。此外，本专利技术人还发现，在此基础上，在USER酶处理后且在环化连接之前，加入PvuI
‑
HF等内切酶处理步骤，可以更进一步提高环化连接效率。
[0013]因此，在一个方面，本专利技术提供了一种DNA环化连接的方法，所述方法包括如下步骤：
[0014](i)在靶DNA片段的两端加上环化接头，以得到带有环化接头的靶DNA片段，
[0015]其中，所述环化接头由5'磷酸化的寡核苷酸长链和与其互补的5'磷酸化的寡核苷酸短链组成，其中，所述寡核苷酸长链的5'端第一个碱基为A碱基，第二个碱基为U碱基；且
[0016]其中，得到的所述带有环化接头的靶DNA片段具有以反向末端重复的形式存在于该靶DNA片段两末端的AU::TA二核苷酸对；
[0017](ii)应用尿嘧啶特异性切除试剂，处理由步骤(i)得到的所述带有环化接头的靶DNA片段，以产生两端均含有3'AT粘性末端的DNA片段；
[0018](iii)采用限制性内切酶处理由步骤(ii)得到的含有3'AT粘性末端DNA片段，以产生经酶切的DNA片段，其中所述限制性内切酶能识别双链DNA并产生3
’
AT粘性末端；
[0019](iv)在允许由步骤(iii)产生的经酶切的DNA片段环化的条件下，温育所述DNA片段，以获得环化的DNA分子。
[0020]在一个实施方案中，在步骤(i)中，所述环化接头通过转座反应，连接到靶DNA片段的两端。
[0021]在另一实施方案中，在步骤(i)中，所述环化接头通过TA尾连接方式，连接到靶DNA片段的两端。
[0022]在一些优选实施方案中，用于步骤(iii)的限制性内切酶选自：PvuI、Pa本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种DNA环化连接方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(i)在靶DNA片段的两端加上环化接头，以得到带有环化接头的靶DNA片段，其中，所述环化接头由5'磷酸化的寡核苷酸长链和与其互补的5'磷酸化的寡核苷酸短链组成，其中，所述寡核苷酸长链的5'端第一个碱基为A碱基，第二个碱基为U碱基；且其中，得到的所述带有环化接头的靶DNA片段具有以反向末端重复的形式存在于该靶DNA片段两末端的AU::TA二核苷酸对；(ii)应用尿嘧啶特异性切除试剂，处理由步骤(i)得到的所述带有环化接头的靶DNA片段，以产生两端均含有3'AT粘性末端的DNA片段；(iii)采用限制性内切酶处理由步骤(ii)产生的DNA片段，以产生经酶切的DNA片段，其中所述限制性内切酶能识别双链DNA并产生3
’
AT粘性末端；(iv)在允许由步骤(iii)产生的经酶切的DNA片段环化的条件下，温育所述DNA片段，以获得环化的DNA分子，优选地，其中，用于所述步骤(iii)的限制性内切酶选自：PvuI、PacI、AsiSI、BstKTI、RgaI、和SfaAI。2.权利要求1的方法，其特征在于，在所述步骤(iv)后，消化未发生环化的线性DNA分子。3.权利要求1的方法，其特征在于，所述步骤(ii)在20℃至45℃进行。4.权利要求1的方法，其特征在于，所述尿嘧啶特异性切除试剂为USER酶。5.权利要求1的方法，其特征在于，所述步骤(i)的所述靶DNA片段具有1kbp至200kbp长度，例如5kbp至20kbp长度。6.权利要求1的...

【专利技术属性】
技术研发人员：任军，高芳芳，张鹏，
申请(专利权)人：序康医疗科技苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：