一种筛选具有优良发育潜能胚胎的无创检测方法技术

本发明专利技术涉及辅助生殖技术领域，更具体涉及在体外受精

【技术实现步骤摘要】
一种筛选具有优良发育潜能胚胎的无创检测方法


[0001]本专利技术涉及辅助生殖
，更具体涉及在体外受精
‑
胚胎移植(IVF
‑
ET)中筛选用于移植的优质胚胎以改善其临床结局的方法、和相关的预测产品及其用途。

技术介绍

[0002]随着中国人口出生率的持续下降，不孕不育问题日益引起关注。目前，体外受精
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胚胎移植(IVF
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ET)技术被越来越多地采纳以治疗不孕不育。在传统IVF
‑
ET操作中，通常会在每个治疗周期向受试者移植一个以上的胚胎，这将导致大约20％的多胎妊娠率。多胎妊娠增加了有碍母体和胎儿健康的不利事件的发生概率。选择性单胚胎移植(eSET)是降低多胎妊娠的最有效方法，并已经日益为国际接受。然而eSET通常获得的妊娠率较低，因此，如何提高eSET的妊娠率，以及如何进行单个囊胚的选择，已成为目前改善eSET临床结局需要迫切解决的问题。
[0003]传统的加德纳形态学囊胚分级系统在临床实际中广泛使用，但是由于该方法依赖于胚胎师的主观判断，缺少客观依据，因此在提升胚胎移植的临床结局上效果有限。
[0004]胚胎植入前异倍体遗传学检测(PGT
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A)也被广泛用于筛选具有潜力的胚胎，其基于全基因组扩增(WGA)技术和基因芯片/基因测序平台，对植入前胚胎的染色体数目异常进行精确的定量检测。PGT
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A技术的应用显著改善了eSET的IVF
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ET临床结局。但是，PGT
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A技术也存在一些争议，由于该技术包括侵入性的活检过程，因此可能对胚胎植入的临床结局带来不利影响，其中最重要的两点是滋养外胚层细胞活检操作可能对胚胎带来潜在损伤，以及少量活检细胞的检测结果无法反映整个胚胎的真实情况。此外，胚胎活检需要专门的设备和技能，难于标准化，每一次的eSET处理都是一个极大的挑战。
[0005]目前无创胚胎植入前遗传学检测成为辅助生殖领域的研究热点和发展趋势。在发现胚胎会向培养液中释放少量游离核酸(cell
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free DNA，cfDNA)之后，多项研究报道了使用胚胎培养液或囊胚腔液来分析染色体倍性，以对胚胎移植潜力进行评估。例如无创胚胎植入潜能筛查(Noninvasive Implantation Capability Screening，)是通过专利技术结合第二代高通量测序的方法，检测培养至囊胚期时培养液中游离的核酸，以游离核酸的检测结果来反映整个胚胎的染色体情况，帮助医生在不进行活检的前提下，得到胚胎染色体的筛查结果，作为甄选移植胚胎的参考条件。但是，基于筛查染色体整倍性的方法比较耗时、并且价格不菲，很难被广泛应用于IVF
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ET。同时，胚胎发育是一个动态变化的过程，例如即便选择整倍性胚胎进行移植，也不一定都能获得持续妊娠，因此还需要其他的预测评估胚胎移植临床结局的新方法和新指标，以提高对胚胎发育潜力的预测精度，降低检测成本和检测门槛，以便在临床实践中方便高效地判断胚胎植入的优先顺序和改善移植胚胎的临床结局。本专利技术满足了该需求。
[0006]本申请专利技术人意外发现胚胎培养液中游离核酸的量以及游离核酸全基因组扩增产物的量与胚胎移植的临床结局呈显著相关性，因此开发了在不进行基因组中拷贝数变异(copy number variation,CNV)检测的情况下筛选优质胚胎并由此获得改善的临床结局的
筛选方法。该方法简便、快捷、低成本，在改善移植胚胎的临床结局的同时为患者节约了大量的时间及经济成本。

技术实现思路

[0007]本专利技术人惊讶地发现，胚胎培养液中游离核酸的原始浓度以及扩增所述胚胎培养液中游离核酸获得的产物(也称为文库)浓度与相应胚胎的临床移植结局密切相关。具体地，胚胎培养液中游离核酸的原始浓度或文库浓度与胚胎移植成功率负相关，浓度越低预示越高的移植成功率。结合胚胎移植临床结局的研究，本专利技术人进一步确立了基于胚胎培养液中游离核酸的原始浓度、胚胎培养液扩增的核酸文库浓度筛选具有移植潜力的胚胎的方法，以及相应用途。
[0008]一方面，本专利技术提供了一种筛选优质胚胎的方法，包括
[0009]1)收获体外培养胚胎的培养液；
[0010]2)对培养液中的核酸进行全基因组扩增；
[0011]3)检测全基因组扩增产物的浓度；和
[0012]4)基于扩增产物浓度筛选胚胎。
[0013]在一个实施方案中，本专利技术提供了一种筛选优质胚胎的方法，包括
[0014]1)收获体外培养胚胎的培养液；
[0015]2)检测培养液中核酸的浓度；和
[0016]3)基于该浓度筛选胚胎。
[0017]第二方面，本专利技术提供了一种筛选可以直接移植的优质胚胎的方法，包括
[0018]1)收获体外培养胚胎的培养液；
[0019]2)对培养液中的核酸进行全基因组扩增；
[0020]3)检测全基因组扩增产物的浓度；
[0021]4)将培养液的扩增产物浓度根据阈值分为低于阈值的组和高于阈值的组；和
[0022]5)将扩增产物浓度低于阈值的组所对应的胚胎鉴定为可以直接进行移植的胚胎。
[0023]在一个实施方案中，本专利技术提供了一种筛选可以直接移植的优质胚胎的方法，包括
[0024]1)收获体外培养胚胎的培养液；
[0025]2)检测培养液中核酸的浓度；
[0026]3)将培养液中核酸的浓度根据阈值分为低于阈值的组和高于阈值的组；和
[0027]4)将低于阈值的组所对应的胚胎鉴定为可以直接进行移植的胚胎。
[0028]第三方面，本专利技术提供了一种预测胚胎移植临床结局的方法，包括：
[0029]1)收获体外培养胚胎的培养液；
[0030]2)对培养液中的游离核酸进行全基因组扩增；
[0031]3)检测全基因组扩增产物的浓度；
[0032]4)将培养液的扩增产物浓度根据阈值分为低于阈值的组和高于阈值的组；
[0033]5)将扩增产物浓度低于阈值的组所对应的胚胎鉴定为具有有益临床结局的胚胎；
[0034]6)对扩增产物浓度高于阈值的组辅助其他筛查方法，以进一步预测该培养液所对应胚胎的临床结局。
[0035]在一个实施方案中，本专利技术提供了一种预测胚胎移植临床结局的方法，包括：
[0036]1)收获体外培养胚胎的培养液；
[0037]2)检测培养液中核酸的浓度；
[0038]3)将培养液中核酸的浓度根据阈值分为低于阈值的组和高于阈值的组；
[0039]4)将低于阈值的组所对应的胚胎鉴定为具有有益临床结局的胚胎；
[0040]5)对高于阈值的组辅助其他筛查方法，以进一步预测该培养液所对应胚胎的临床结局。
[0041]第四方面，本专利技术提供了一种用于改善胚胎移植临床结局的方法，优选地所述胚胎移植为单囊胚移植，所述方法包本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种筛选用于移植的优质胚胎的方法，包括1)收获体外培养胚胎的培养液；2)对培养液中的核酸进行全基因组扩增；3)检测全基因组扩增产物的浓度；和4)基于扩增产物浓度筛选用于移植的优质胚胎，或所述方法包括：1)收获体外培养胚胎的培养液；2)检测培养液中核酸的原始浓度；和3)基于该浓度筛选胚胎。2.权利要求1的方法，其中所述培养液是在IVF
‑
ET的胚胎体外培养过程中D1
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D10的胚胎培养液，优选D3
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D7的胚胎培养液，更优选是D5
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D7的培养液；任选地在胚胎培养至第4天时对培养液进行换液处理。3.权利要求1的方法，其中采用文库构建方法、SurePlex DNA扩增系统或DOP
‑
PCR技术对培养液中的游离核酸进行全基因组扩增；任选地，其中在扩增前采用常规方法对培养液进行裂解。4.权利要求1
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3中任一项的方法，其中采用qPCR、核酸染料法、紫外吸收法、电泳等方法对扩增的产物的浓度进行检测；采用qPCR方法对培养液中核酸的原始浓度进行检测，优选地，通过检测GAPDH基因，TBC1D3基因，18S或duf1220以对培养液中核酸的原始浓度进行检测。5.权利要求1
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4中任一项的方法，其中测得的扩增产物浓度介于0
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100ng/μl之间，介于0
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50ng/μl之间。6.权利要求1
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5中任一项的方法，其中还包括对获得的扩增产物浓度按照从低到高的顺序排序，其中，扩增产物浓度越低，与该培养液相对应的胚胎越为具有移植潜能的优质胚胎，越具有有益的临床结局，优选地，所述临床结局是临床妊娠结局；或者，所述方法还包括对培养液中核酸的原始浓度按照从低到高的顺序排序，其中，原始浓度越低，与该培养液相对应的胚胎越为具有移植潜能的优质胚胎，越具有有益的临床结局，优选地，所述临床结局是临床妊娠结局。7.权利要求1
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6中任一项的方法，其中还包括将测得的扩增产物浓度与阈值比较的步骤，优选地，所述全基因组扩增产物浓度阈值是1.083ng/μl，其中浓度低于阈值的扩增产物所对应的胚胎为优质胚胎；或者，该方法包括将测得的培养液中核酸的原始浓度与阈值比较的步骤，优选地，所述原始核酸浓度的阈值是0.15pg/μl，其中原始浓度低于阈值的培养液所对应的胚胎为优质胚胎。8.一种筛选可以直接移植的优质胚胎的方法，包括1)收获体外培养胚胎的培养液；2)对培养液中的游离核酸进行全基因组扩增；3)检测全基因组扩增产物的浓度；4)将培养液依据其扩增产物浓度与全基因组扩增产物浓度的阈值比较，由此分为低于
阈值的培养液组和高于阈值的培养液组；和5)将低于阈值的培养液组所对应的胚胎鉴定为可以直接进行移植的优质胚胎，或者，该方法包括：1)收获体外培养胚胎的培养液；2)检测培养液中原始核酸的浓度；3)将培养液中核酸的原始浓度根据培养液原始核酸浓度阈值分为低于阈值的组和高于阈值的组；和4)将低于阈值的组所对应的胚胎鉴定为可以直接进行移植的胚胎。9.权利要求8的方法，其中所述全基因组扩增产物浓度的阈值是1.083ng/μl，其中所述培养液原始核酸浓度阈值是0.15pg/μl。10.权利要求8或9的方法，其中所述培养液是在IVF
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ET的胚胎体外培养过程中D1
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D10的胚胎培养液，优选D3
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D7的胚胎培养液，更优选是D5
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D7的培养液；任选地，其中所述胚胎培养液在胚胎培养至第4天时进行换液处理。11.权利要求8
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10中任一项的方法，其中采用文库构建方法、SurePlex DNA扩增系统或DOP
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PCR技术对培养液中的游离核酸进行全基因组扩增，任选地，其中在扩增前采用常规方法对培养液进行裂解。12.权利要求8
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11中任一项的方法，其中采用qPCR、核酸染料法、紫外吸收法、电泳等方法对扩增的产物的浓度进行检测；或者其中采用qPCR方法对培养液中核酸原始浓度进行检测，优选地，通过检测GAPDH基因，TBC1D3基因，18S或duf1220以对培养液中核酸的原始浓度进行检测。13.一种预测胚胎移植临床结局的方法，包括：1)收获体外培养胚胎的培养液；2)对培养液中的游离核酸进行全基因组扩增；3)检测全基因组扩增产物的浓度；4)将培养液依据其扩增产物浓度与全基因组扩增产物浓度的阈值比较，分为低于阈值的培养液组和高于阈值的培养液组；5)将低于阈值的培养液组所对应的胚胎鉴定为具有有益临床结局的胚胎；任选地，6)对高于阈值的培养液...

【专利技术属性】
技术研发人员：姚雅馨，陆思嘉，乔菁菁，赵敦梅，万成，任军，
申请(专利权)人：序康医疗科技苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：