一种快速数字PCR预混液及其制备方法与应用技术

本发明专利技术涉及一种快速数字PCR预混液及其制备方法与应用，所述预混液包含以下组分：DNA聚合酶；PCR反应缓冲液：1)低聚糖及衍生物2)KCl,3)MgCl2，4)Tris

【技术实现步骤摘要】
一种快速数字PCR预混液及其制备方法与应用


[0001]本专利技术涉及数字PCR的核酸检测领域，尤其涉及一种快速数字PCR预混液及其制备方法与应用。

技术介绍

[0002]数字PCR(dPCR)又称为数字微流控，将含有核酸模板的反应体系分隔成了众多微小独立反应体系，理想状态下每个微反应体系中至多含有1个分子的核酸模板。和qPCR不同，数字PCR不对扩增过程进行实时监测，而是检测end
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point的荧光信号。扩增完成后所有液滴的荧光将逐个被识别并进行计数，不需要构建标准曲线，就可以得到绝对定量的结果。数字PCR是新一代PCR技术，与荧光定量PCR(qPCR)相比，数字PCR具有灵敏度高、精准快速、高通量、检测样品多样等优势。
[0003]市面上普遍微滴式数字pcr试剂扩增时间长、生成微滴数不稳定，现亟需一种快速数字PCR预混液在同样的循环数下，将大大缩短扩增时间，扩增稳定性好，微滴大小均匀，数量稳定，不易形成气溶胶污染，且染料发适配多种染料。

技术实现思路

[0004]鉴于上述问题，本专利技术的目的是提供一种快速数字PCR预混液及其制备方法与应用，用于与微滴生成油混合后形成稳定微滴，且扩增时间短，不易形成气溶胶污染，成本低，且染料发适配多种染料，以克服上述现有技术的不足。
[0005]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0006]一种快速数字PCR预混液，所述预混液包含以下组分：DNA聚合酶；PCR反应缓冲液：1)低聚糖及衍生物2)KCl,3)MgCl2，4)Tris
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HCl，5)DMSO，6)含有聚环氧乙烷结果的高聚物；密封油。
[0007]作为本专利技术的优选，还包含有染料，所述染料为SYBRGreenI、EvaGreen中的一种。
[0008]作为本专利技术的优选，探针法的预混液(mix)具体成分的浓度比为：1U DNA聚合酶，10*PCR buffer：100
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500mM KCl、20mM
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200mM MgCl2、1
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30mM Tris
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HCl、1％
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10％ DMSO、0.1％
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5％含有聚环氧乙烷结果的高聚物、0.1％
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5％低聚糖及衍生物。
[0009]作为本专利技术的优选，染料法的预混液(mix)具体成分的浓度比为：1U DNA聚合酶，10*PCR反应缓冲液：100
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500mM KCl、20mM
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200mM MgCl2、1
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30mM Tris
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HCl、1％
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10％ DMSO、0.1％
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5％含有聚环氧乙烷结果的高聚物、0.1％
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5％低聚糖及衍生物、1x荧光染料：其中染料是SYBRGreenI、EvaGreen中的一种。
[0010]本专利技术提供的一种PCR预混液的制备方法，具体包括以下步骤：
[0011](1)将ddPCR探针法预混液(mix)、引物/探针、模板混合；
[0012](2)将30μl的扩增试剂与70μl的油相分别加入到微滴生成芯片中通过微滴生成仪进行微滴生成；
[0013](3)将生成的微滴转移到新的PCR八连管中，并加入20μl密封油进行扩增，扩增程
序：95℃，1min；95℃，10s，60℃，1min，40个循环，4℃保持；
[0014](4)将八连管开盖后，放入数字PCR读数仪进行样本的分析。
[0015]本专利技术提供的另一种PCR预混液的制备方法，具体包括以下步骤：
[0016](1)将ddPCR染料法预混液(mix)、引物/探针、模板混合；
[0017](2)将30μl的扩增试剂与70μl的油相分别加入到微滴生成芯片中通过微滴生成仪进行微滴生成；
[0018](3)将生成的微滴转移到新的PCR八连管中，并加入20μl密封油进行扩增，扩增程序：95℃，1min；95℃，10s，60℃，1min，40个循环，4℃保持；
[0019](4)将八连管开盖后，放入数字PCR读数仪进行样本的分析。
[0020]本专利技术中的探针法在配备适用于快速数字PCR读数仪的PCR预混液检测中的应用。
[0021]本专利技术中的染料法在配备适用于快速数字PCR读数仪的PCR预混液检测中的应用。
[0022]本专利技术的优点及积极效果是：
[0023]1、本专利技术的快速数字PCR预混液，在同样的循环数下，将大大缩短扩增时间，扩增稳定性好，微滴大小均匀，数量稳定，不易形成气溶胶污染，且染料发适配多种染料。
[0024]2、本专利技术可以与微滴生成油混合后形成稳定微滴，大小均匀，且扩增时间短，成本低。
附图说明
[0025]图1是实施例1中分别对两种浓度的模板进行检测均可以得到可靠的检测结果示意图；
[0026]图2是实施例2中分别对两种浓度的模板进行检测均可以得到可靠的检测结果示意图。
具体实施方式
[0027]在下面的描述中，出于说明的目的，为了提供对一个或多个实施例的全面理解，阐述了许多具体细节。然而，很明显，也可以在没有这些具体细节的情况下实现这些实施例。在其它例子中，为了便于描述一个或多个实施例，公知的结构和设备以方框图的形式示出。
[0028]实施例1：探针法
[0029](1)在室温将所有试剂解冻，混合均匀；
[0030](2)按照反应体系将所有组分加入到PCR管中，混合均匀；
[0031][0032]其中ddPCR探针法mix包括：1U DNA聚合酶，10*PCR buffer：300
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500mM KCl、100mM
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200mM MgCl2、1
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30mM Tris
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HCl、3％
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10％ DMSO、0.1％
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5％含有聚环氧乙烷结果的高聚物、0.1％
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5％低聚糖及衍生物。
[0033](3)取30μl预混液加入到芯片的样品孔，取70μl微滴生成油加入到油孔，根据微滴生成仪说明书进行微滴生成；
[0034](4)将生成的微滴转移到新的PCR管中，并加入20μl密封油进行扩增，扩增程序如下；
[0035][0036](5)将八连管开盖后，放入数字PCR读数仪进行样本的分析。分别对两种浓度的模板进行检测均可以得到可靠的检测结果，结果如图1所示。
[0037]实施例2：染料法
[0038](1)在室温将所有试剂解冻，混合均匀；
[0039](2)按照反应体系将所有组分加入到PCR管中，混合均匀；
[0040][0041]其中ddPCR染料法mix包括：1U DNA聚合酶，10*PCR反应缓冲液：300
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种快速数字PCR预混液，其特征在于，所述预混液包含以下组分：DNA聚合酶；PCR反应缓冲液：1)低聚糖及衍生物2)KCl,3)MgCl2，4)Tris
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HCl，5)DMSO，6)含有聚环氧乙烷结果的高聚物；密封油。2.根据权利要求1所述的一种快速数字PCR预混液，其特征在于，还包含有染料，所述染料为SYBRGreenI、EvaGreen中的一种。3.根据权利要求1所述的一种快速数字PCR预混液，其特征在于，探针法的预混液具体成分为：1U DNA聚合酶，10*PCR buffer：100
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500mM KCl、20mM
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200mM MgCl2、1
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30mM Tris
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HCl、1％
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10％DMSO、0.1％
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5％含有聚环氧乙烷结果的高聚物、0.1％
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5％低聚糖及衍生物。4.根据权利要求1所述的一种快速数字PCR预混液，其特征在于，染料法的预混液具体成分为：1U DNA聚合酶，10*PCR反应缓冲液：100
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500mM KCl、20mM
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200mM MgCl2、1
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30mM Tris
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HCl、1％
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10％DM...

【专利技术属性】
技术研发人员：褚春旭，高玉舟，石鑫，潘虹，曹阳，
申请(专利权)人：长春国科希莱科技有限公司，
类型：发明
国别省市：