从生物分子组合物中检测和去除聚乙烯基磺酸盐制造技术

本披露提供了用于评估样品中抑制PCR反应的聚阴离子化合物的存在和水平的材料和方法，包括针对聚乙烯基磺酸盐的存在以及任选地量的测定；以及提供了使用各种方法，包括基于滴定的技术从缓冲溶液和蛋白质溶液中减少或去除此类化合物的材料和方法。除此类化合物的材料和方法。除此类化合物的材料和方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】从生物分子组合物中检测和去除聚乙烯基磺酸盐
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2020年10月16日提交的美国临时专利申请号63/093,120的优先权，将其通过引用以其全文特此并入。
[0003]通过引用并入以电子方式提交的材料
[0004]作为本披露的一部分的序列表以文本文件的形式与本说明书同时提交。含有序列表的文本文件的名称为“55057A_Seqlisting.txt”，创建于2021年10月4日，并且大小为1,070字节。序列表的主题通过引用以其整体并入本文。


[0005]本公开总体上涉及生物分子纯化领域，更具体地，涉及蛋白质纯化。

技术介绍

[0006]生物制品和生物仿制药的潜力现在正在实现，这些治疗类别对人类和其他动物疾病和病症的可用治疗库做出了越来越大的贡献。这些产品，包括重组蛋白、各种形式的抗体及其保留结合能力的片段、和疫苗，都在宿主细胞中表达，包括细菌、酵母、动物细胞(如哺乳动物细胞)和连续细胞系。正如在细胞培养中发现的那样，这些产品与各种污染物质(包括宿主细胞DNA的片段)混合。此外，残留量的宿主细胞DNA可以在严格的纯化过程中存活下来，在纯化的蛋白质(如生物制品)的制备中作为有害杂质残留。待施用给动物(例如人类患者)的蛋白质配制品中包含的残留宿主细胞DNA可能会引发不希望有的免疫反应或增加患癌症的风险。因此，世界各地的监管机构都对施用给人类的配制品中所含宿主细胞DNA的浓度进行了限制。世界卫生组织(WHO)和欧盟(EU)允许残留宿主细胞DNA的量高达10ng/剂量，而美国食品和药物管理局允许不超过100pg/剂量。需要用于检测和定量低水平宿主细胞DNA的准确、精确和灵敏的方法，以确保用于施用的纯化的蛋白质配制品低于这些阈值。此外，用于有效生产这些蛋白质的细胞培养物含有宿主细胞DNA以外的杂质。其中一些杂质，例如小分子化合物，会对这些细胞产生的生物制品和生物仿制药(即，靶蛋白)产生直接的有害影响，例如通过抑制靶蛋白的转录或翻译，抑制表达的靶蛋白的活性，或通过在靶蛋白经历纯化过程时干扰测量或监测靶蛋白的努力。
[0007]在基于培养的重组靶蛋白表达中使用的活细胞中通常存在的一些聚阴离子化合物可以作为细胞培养物中的杂质被发现。此外，在缓冲液和细胞培养基中发现的这些聚阴离子化合物中的一些是各种酶的已知抑制剂。聚乙烯基磺酸盐(PVS)是聚阴离子化合物，是几种酶(包括RNA酶和DNA聚合酶)的已知抑制剂。PVS还已知存在于2
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乙磺酸(MES)的制剂中，MES是生物治疗剂加工和纯化操作中的常见缓冲液。PVS也可能(不希望地)存在于其他缓冲系统中，例如Goods缓冲液(其使用乙烯基磺酸盐作为起始材料)。
[0008]因此，本领域一直需要对包含在旨在施用给人或其他动物的蛋白质配制品中的宿主细胞DNA进行准确定量的方法。此外，仍然需要从旨在用于这样的施用的蛋白质配制品中减少或去除这样的杂质的方法。

技术实现思路

[0009]本公开提供了测定聚阴离子PCR抑制剂例如聚乙烯基磺酸盐化合物的方法。这些化合物抑制多种酶，包括核酸聚合酶，例如DNA聚合酶。甚至现在在PCR扩增方法中占主导地位的DNA聚合酶的工程化形式也受到这些化合物的抑制，并且本文的公开内容提供了检测和定量这些抑制性化合物的方法。本公开还提供了从缓冲液(例如MES和Goods缓冲液)以及蛋白质溶液中去除这样的化合物的方法。这些方法通过提供监测PCR抑制剂的主要类别的存在的方法，在生物制品和蛋白质的加工方面提供了重大进步，这些PCR抑制剂给监测细胞培养中产生的生物制品纯度的努力造成挫折，其中必须监测宿主DNA以确保目的蛋白的纯度足以用作人类和/或其他动物的治疗剂。
[0010]在一方面，本公开提供了一种用于定量样品中聚阴离子PCR抑制剂的方法，所述方法包括：a)制备包含至少四个成员的样品的稀释系列；b)用恒定量的可与宿主细胞DNA区分的模板DNA加标所述稀释系列的每个成员；c)对所述稀释系列的每个成员和在没有任何样品的情况下所述恒定量的模板DNA进行PCR测定；d)生成聚阴离子抑制剂标准曲线；e)将所述稀释系列的PCR测定结果与在没有任何样品的情况下所述恒定量的模板DNA的PCR测定结果进行比较；以及f)鉴定所述样品中聚阴离子PCR抑制剂的浓度。在一些实施例中，样品中聚阴离子PCR抑制剂的浓度是由以下定义的范围：所述稀释系列中显示完全加标回收的最低稀释的成员中和所述稀释系列中未显示完全加标回收的最高稀释的成员中聚阴离子PCR抑制剂的浓度。在一些实施例中，稀释系列中的成员数量为5、6、7、8、9、10、12、15或20个，从而相对于通过测定稀释系列的较少成员提供的范围，缩小样品中聚阴离子PCR抑制剂的浓度范围。在一些实施例中，恒定量的模板DNA是至少100pg。在一些实施例中，聚阴离子PCR抑制剂是砜(磺酸盐)化合物，例如聚乙烯基磺酸盐。在一些实施例中，聚乙烯基磺酸盐是用于生成聚阴离子抑制剂标准曲线的聚阴离子PCR抑制剂，并且样品中聚阴离子PCR抑制剂的浓度是以聚乙烯基磺酸盐浓度当量的单位。一些实施例进一步包括用一种或多种量的聚阴离子PCR抑制剂(例如聚乙烯基磺酸盐)加标充分稀释以恢复扩增的样品，从而证明添加抑制剂时扩增的恢复受损或丢失。
[0011]本公开的另一方面涉及一种从缓冲溶液中去除聚阴离子PCR抑制剂(聚阴离子杂质)的方法，所述方法包括：a)制备酸性缓冲物质、碱性缓冲物质或其组合的缓冲溶液；b)将所述缓冲溶液与阴离子交换介质接触；以及c)将所述缓冲溶液与聚阴离子杂质分离，从而从所述缓冲溶液中去除所述聚阴离子杂质。本公开的一个相关方面提供了一种从缓冲溶液中去除聚阴离子PCR抑制剂的方法，所述方法包括：a)制备酸性缓冲物质、碱性缓冲物质或其组合的缓冲溶液；b)将所述缓冲溶液与混合模式树脂接触；以及c)将所述缓冲溶液与聚阴离子杂质分离，从而从所述缓冲溶液中去除所述聚阴离子杂质。在用于去除聚阴离子PCR抑制剂的上述任一方法中，用于该方法的缓冲液的体积没有限制并且可以从毫升范围内的小分析体积扩展到涉及许多升的商业规模缓冲制剂。在任一去除方法的一些实施例中，聚阴离子杂质是砜(磺酸盐)化合物，例如聚乙烯基磺酸盐。在任一去除方法的一些实施例中，缓冲溶液是Good缓冲溶液，例如2
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乙磺酸(MES)缓冲溶液。在任一去除方法的一些实施例中，缓冲溶液包含缓冲盐或所述缓冲盐的酸物质。每种去除方法的一些实施例还包括将至少一种改性化合物添加到缓冲溶液中。在任一去除方法的一些实施例中，改性化合物是非缓冲盐、赋形剂或两者。
[0012]在涉及阴离子交换介质的去除方法的一些实施例中，阴离子交换介质是二乙基氨基乙基改性的基质、二甲基氨基乙基改性的基质、二甲基氨基丙基改性的基质、聚乙烯亚胺改性的基质、季铵化聚乙烯亚胺改性的基质、完全季铵化的胺改性的基质、含阴离子交换本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于定量样品中聚阴离子PCR抑制剂的方法，所述方法包括：a)制备包含至少四个成员的样品的稀释系列；b)用恒定量的可与宿主细胞DNA区分的模板DNA加标所述稀释系列的每个成员；c)对所述稀释系列的每个成员和在没有任何样品的情况下所述恒定量的模板DNA进行PCR测定；d)生成聚阴离子抑制剂标准曲线；e)将所述稀释系列的PCR测定结果与在没有任何样品的情况下所述恒定量的模板DNA的PCR测定结果进行比较；以及f)鉴定所述样品中聚阴离子PCR抑制剂的浓度。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品中聚阴离子PCR抑制剂的浓度是由以下定义的范围：所述稀释系列中显示完全加标回收的最低稀释的成员中和所述稀释系列中未显示完全加标回收的最高稀释的成员中聚阴离子PCR抑制剂的浓度。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述稀释系列中的成员数量为5、6、7、8、9、10、12、15或20个，从而相对于权利要求2中提供的范围，缩小所述样品中所述聚阴离子PCR抑制剂的浓度的范围。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述恒定量的模板DNA是至少100pg。5.根据权利要求1所述的方法，其中所述聚阴离子PCR抑制剂是磺酸盐化合物。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述磺酸盐化合物是聚乙烯基磺酸盐。7.根据权利要求1所述的方法，其中所述聚乙烯基磺酸盐是用于生成所述聚阴离子抑制剂标准曲线的聚阴离子PCR抑制剂，并且所述样品中聚阴离子PCR抑制剂的浓度是以聚乙烯基磺酸盐浓度当量的单位。8.一种从缓冲溶液中去除聚阴离子PCR抑制剂的方法，所述方法包括：a)制备酸性缓冲物质、碱性缓冲物质或其组合的缓冲溶液；b)将所述缓冲溶液与阴离子交换介质接触；以及c)将所述缓冲溶液与聚阴离子杂质分离，从而从所述缓冲溶液中去除所述聚阴离子杂质。9.一种从缓冲溶液中去除聚阴离子PCR抑制剂的方法，所述方法包括：a)制备酸性缓冲物质、碱性缓冲物质或其组合的缓冲溶液；b)将所述缓冲溶液与混合模式树脂接触；以及c)将所述缓冲溶液与聚阴离子杂质分离，从而从所述缓冲溶液中去除所述聚阴离子杂质。10.根据权利要求8或权利要求9所述的方法，其中所述聚阴离子杂质是磺酸盐化合物。11.根据权利要求10所述的方法，其中所述磺酸盐化合物是聚乙烯基磺酸盐。12.根据权利要求8或权利要求9所述的方法，其中所述缓冲溶液是Good缓冲溶液。13.根据权利要求12所述的方法，其中所述Good缓冲溶液是2
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乙磺酸(MES)缓冲溶液。14.根据权利要求8或权利要求9所述的方法，其中所述缓冲溶液包含缓冲盐或所述缓冲盐的酸物质。15.根据权利要求8或权利要求9所述的方法，所述方法还包括向所述缓冲溶液中添加
至少一种改性化合物。16.根据权利要求15所述的方法，其中所述改性化合物是非缓冲盐、赋形剂或两者。17.根据权利要求8所述的方法，其中所述阴离子交换介质是二乙基氨基乙基改性的基质、二甲基氨基乙基改性的基质、二甲基氨基丙基改性的基质、聚乙烯亚胺改性的基质、季铵化聚乙烯亚胺改性的基质、完全季铵化的胺改性的基质、含阴离子交换改性硅藻土的深度过滤器、阴离子交换膜吸附剂、耐盐阴离子交换膜吸附剂、Macro
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Prep 25Q、TSK
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Gel Q、Poros Q、快流速Q琼脂糖凝胶、QHyperD、Q氧化锆、源30Q、Fractogel EMD TMAE、表达离子Q、快流速DEAE琼脂糖凝胶、Poros 50D、Fractogel EMD DEAE(M)、MacroPrep DEAE支持物、DEAE陶瓷HyperD 20、东洋珍珠DEAE 650M、Capto Q、Sartobind Q膜吸附剂、Posidyne带电膜、(聚胺)改性的基质、(亚氨基二乙酸)改性的基质、I型(三烷基苄基铵)改性的基质、II型(二甲基
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羟基乙基苄基铵)改性的基质、(聚胺)改性的基质、I型(三甲基苄基铵)改性的基质、II型(二甲基
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羟基乙基苄基铵)改性的基质、(混合床)、附着阴离子交换多模式、PPA Hypercel、HEA Hypercel、或(聚胺)改性的基质。18.根据权利要求9所述的方法，其中所述混合模式树脂是附着阴离子交换多模式树脂、PPA Hyperc...

【专利技术属性】
技术研发人员：N，
申请(专利权)人：美国安进公司，
类型：发明
国别省市：