用于病原微生物快速检测的定量参考品和检测方法技术

本发明专利技术公开了用于病原微生物快速检测的定量参考品和检测方法，本发明专利技术提供的定量参考品的序列与任意物种的核酸序列均不重叠，并基于该定量参考品提供了一种病原微生物快速检测方法。本发明专利技术通过引入定量参考品，在建库阶段即可通过样本浓度和毛细管电泳结果直观判断建库是否成功，极大缩短了失败样本判断时间与成本，进而缩短实验周期；而且本发明专利技术方法可用于检测含有人源基因组DNA的核酸样本，不仅检出限低，且可实现大量不同类型病原微生物的同时检出，检测时间也可缩短至4

【技术实现步骤摘要】
用于病原微生物快速检测的定量参考品和检测方法


[0001]本专利技术属于病原微生物检测
，具体涉及一种用于病原微生物检测的定量参考品和检测方法。

技术介绍

[0002]传统的病原微生物检测依赖于体外培养试验，多使用固体培养基或者液体培养基做体外培养，由于病原微生物的生长繁殖需要一定时间，导致检测周期较长，且不同的病原微生物的生长速度差异很大，还不能同时处理批量样本。为解决这一问题，各种自动化培养和鉴定系统不断产生，传统鉴定方法也在逐步改进，大大加快了检验速度。组织细胞培养鉴定方法适于专营活组织细胞内生存的病原体，包括病毒、立克次体、衣原体等。不同病原体敏感的组织细胞是不一样的，将活细胞从病原体敏感的动物组织中取出在体外进行原代培养或用病原体敏感细胞系进行传代培养，再将病原体接种于相应的组织细胞中后，病原体可在其中繁殖增长，引起特异性的细胞病变效应。也可以将病原体直接接种于敏感动物体内，引起相应组织器官出现特异的病理学改变。往往可以根据这些特异的病变对病原体进行鉴定。血清学与免疫学检测是通过已知的抗体或抗原来检测病原体的抗原或抗体从而对病原体进行快速鉴定的技术，简化了鉴定步骤，常用的方法包括血清凝集技术、乳胶凝集实验、荧光抗体检测技术、协同凝集试验、酶联免疫测试技术等。酶联免疫技术的应用大大提高了血清学检测的敏感性和特异性，不仅可检测样本中病原体抗原，也可检测机体的抗体成分。常规病原微生物检测方法操作繁琐，检测周期长，而且对操作人员技术水平要求比较高。随着技术的不断发展，对病原微生物诊断已不再局限于病原体水平，而是深入到了基因水平。病原微生物的核酸序列即基因片段都是特异的，有别于其他非病原微生物，检测其特有的基因片段序列可用来鉴别病原微生物。随着科技的发展，基因检测技术正在蓬勃发展，成为临床检验科和基础实验室对病原微生物检测的重要检测技术。
[0003]目前Sanger测序法是测序的金标准，同时也是应用最广泛测序技术，它可以鉴定和检测不同种类的病原菌。随着基因组学技术的发展，高通量测序技术(NGS)越来越广泛地应用于感染性疾病的溯源、检测、分型和耐药评估等各个方面，并且朝着快捷、经济的方向飞速发展。宏基因组学测序(mNGS)技术在临床感染中不依赖于特定基因引物的序列扩增，而是将待测样本的所有DNA或RNA混合测序，并通过将测序数据与病原体数据库进行比对，获得病原体的分类信息，因此能在较短的时间内完成对样本的无靶向检测，单次即可检测上千种病原体，检测的病原体种类包含病毒、细菌、真菌和寄生虫等。从接收样本至完成数据分析，基于二代测序的检测的周转时间根据测序技术、方法和生物信息学分析方法的不同而不同，平均检测时间在48h，而且为了降低测序时间，目前在48h内完成检测的都是测序单端50bp，属于短序列的测序。目前二代测序检测的成本仍显著高于传统实验室检测方法，高成本仍是制约二代测序在国内广泛开展的主要因素之一。而且，采用二代测序平台进行宏基因组的测序，该平台存在测序时间长、测序读长短，测序结果存在大量人源基因组DNA污染、测序数据量高且测序结果较难解读的问题。
[0004]纳米孔靶向测序(Nanopore Targeted Sequencing)方法是一种代表性的基因检测技术，该方法不依赖于传统的微生物培养，能够快速、客观地检测出临床样本中的疑似致病微生物(包括细菌、真菌和病毒)。该检测项目基于第三代单分子测序(Nanopore)平台，是新一代单分子实时测序技术，其以单分子DNA(RNA)通过生物纳米孔的电流变化推测碱基组成而进行测序。其主要特点是读长更长，平均读长可达20kb，最长可达到Mb级别；结合高效的基因组核酸提取和建库方式，测序结果经过生物信息学处理分析后与专业医学微生物数据库进行比对分析，可以获得样本中所有微生物的种属信息以及所携带的耐药和毒力基因信息。该方法检测范围广，可高效检测静脉血、肺泡灌洗液、脑脊液、痰液及其他体液、组织等多种临床样本中的致病微生物，适用于不明原因发热、疑难感染和急危重症的诊断。

技术实现思路

[0005]本专利技术旨在提供能够用于病原微生物快速检测的定量参考品，以及基于该定量参考品进行病原微生物快速检测的方法，该方法具有建库成功率高、实验周期短、检出限低等优点。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术的技术方案具体如下：
[0007]一种用于病原微生物快速检测的定量参考品，该定量参考品通过人工合成，且其序列需要与现有数据库中任何物种的基因序列都不重叠；所述不重叠具体为：定量参考品的序列与任意物种中任一相同长度序列的相似度＜75％。
[0008]一种基于Nanopore测序平台的病原微生物快速检测方法，该检测方法在多重PCR扩增反应体系中加入定量参考品，具体包括以下步骤：
[0009]S1、将定量参考品、核酸样本、特异性引物组置于同一反应体系中进行多重PCR扩增，其中，特异性引物组中含有特异性扩增所述定量参考品的引物；
[0010]S2、以S1所得扩增产物为模板，进行加标签序列扩增，将扩增产物连接测序接头后采用Nanopore测序平台获得测序数据，再对所述测序数据分析，即可得到待测样品中含有的病原微生物种类。
[0011]在上述方法中，依据检测需要，每个反应体系中可以加入5～16种不同的定量参考品，不过各定量参考品序列之间需要保持一定差异，这样便于基于序列进行拆分。
[0012]本专利技术通过加入定量参考品，在建库阶段即可通过样本浓度和毛细管电泳结果直观判断建库是否成功，极大缩短了失败样本判断时间与成本，可以在第一时间安排失败样本重新建库，缩短实验周期。
[0013]在上述方法中，核酸样本中可以含有人源基因组DNA，即提取待测样品的核酸时无需进行人源基因组DNA的去除，故使用常规的磁珠法等自动化仪器提取的DNA和RNA即可以满足后续建库测序的要求。
[0014]本专利技术提供的方法特别适配于病原微生物含量极低的临床样本，在提取DNA总量在50pg以上即可完成检测，可以极显著的提升微量样本的建库成功率，同时在使用标准样品进行测试时，在反应体系中的拷贝数低至2个拷贝每个反应时仍可以实现正常的检出。所述临床样本可以是常规的血液、肺泡灌洗液、脑脊液、胸腹水、口腔拭子、脓液等多种类型。
[0015]而且，基于本专利技术的方法，经过对多重扩增体系的优化后，在不进行人源基因组DNA去除的情况下，测序数据中微生物的占比就可以达到95％以上，解决了病原微生物检测
中人源基因组DNA污染的难题。
[0016]在上述方法中，特异性引物组中的引物用于靶向扩增富集病原微生物的靶标区域以及定量参考品，每个病原微生物可以设计多个靶标区域(如5～10个)，能极大的提高病原微生物判的准确性和稳定性。
[0017]优选地，本专利技术可以采用两段式的扩增方式，第一轮扩增所用的特异性引物组中的引物具有以下特征：引物由两部分组成，即位于5
’
端的通用序列和位于3
’
端特异性序列，特异性序列基于各靶标区域设计得到。在本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于病原微生物快速检测的定量参考品，其特征在于，所述定量参考品的序列与任意物种的核酸序列均不重叠，且定量参考品的序列长度为150～2500bp。2.一种基于Nanopore测序平台的病原微生物快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、将权利要求1所述的定量参考品、核酸样本、特异性引物组置于同一反应体系中进行多重PCR扩增，所述特异性引物组中含有特异性扩增所述定量参考品的引物；S2、以S1所得扩增产物为模板，进行加标签序列扩增，所得扩增产物连接测序接头后采用Nanopore获得测序数据，对所述测序数据分析即得。3.根据权利要求2所述的病原微生物快速检测方法，其特征在于，步骤S1所述的反应体系中含有5～16种不同序列的定量参考品。4.根据权利要求2所述的病原微生物快速检测方法，其特征在于，步骤S1中核酸样本中含有人源基因组DNA。5.根据权利要求2所述的病原微生物快速检测方法，其特征在于，所述核酸样本中核酸总...

【专利技术属性】
技术研发人员：张骥诚，王颖，廖瑞，方涛，龙志成，赵淑云，
申请(专利权)人：武汉明德生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：