本发明专利技术公开了一种检测动物体内人源细胞产品分布的方法。以人源特异基因片段为靶点，设计检测引物，通过绝对定量qPCR检测样品中人源基因组DNA在接种细胞产品的动物组织器官样品DNA中所占的比例来分析人源细胞产品在动物体内的分布情况。本发明专利技术公开的检测方法不需要对细胞事先进行标记，不会影响细胞的生物学特性，成本低，特异性好，灵敏度高，具有良好的重现性，可用于细胞产品的临床前药代动力学研究。究。
【技术实现步骤摘要】
一种检测动物体内人源细胞产品分布的方法
[0001]本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种检测动物体内人源细胞产品分布的方法。
技术介绍
[0002]细胞治疗技术是指将自体或异体来源的干细胞或体细胞在体外进行扩增培养后或者经过基因改造后应用于人体，用于治疗相关疾病的技术。一般包括干细胞治疗和免疫细胞治疗，所用干细胞包括间充质干细胞、胚胎干细胞、诱导多能干细胞(iPSC)等；所用免疫细胞包括嵌合抗原受体T细胞(CAR
‑
T)、T细胞受体嵌合T细胞(TCR
‑
T)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、NK、DC、CIK细胞等。
[0003]细胞产品来源于人体，是活的药物，可以增殖，具有主动驱化迁移的功能特性，可通过多种途径发挥作用，但某些细胞产品的作用机制尚未特别明确。药物进入体内后的药代动力学情况可为阐明其药理毒理作用、机制，确定给药剂量、给药周期等提供重要的数据支撑。因此，对细胞产品进行药代动力学研究是明确其作用机制的重要手段。研究时，首要的是通过动物模型检测细胞产品在体内的分布情况，了解其在体内的分布规律。啮齿类动物模型及非人灵长类动物模型是临床前研究常用的动物模型，开发接种人源细胞产品后啮齿类及非人灵长类动物体内人源细胞产品分布情况的检测方法对于细胞产品的临床前药代动力学研究具有重要的意义。
[0004]现有的动物体内人源细胞产品分布情况的检测方法包括：1)传统染料染色法：将细胞染色后，接种至动物体内，组织切片观察。该方法缺点是灵敏度低，无法准确定量。2)小动物活体成像法：将细胞膜标记荧光染料或同位素染料、将细胞质标记同位素染料或者将细胞添加基因标记，接种至动物体内后，使用小动物成像系统进行观测，缺点是需要对细胞添加标记，有影响细胞本身活性的风险，同时设备昂贵，不易推广使用。3)流式细胞术检测法：组织分布检测时需进行单细胞悬液制备，操作复杂，对技术要求较高。4)实时荧光定量PCR法(Quantitative Real
‑
time PCR，qPCR)：选择人类基因组序列中与动物基因组序列的差异片段，设计qPCR检测引物，用以检测动物组织器官样品中人源细胞产品的含量，难度在于找到特异、灵敏的检测靶点。
[0005]目前，现有技术已报道的实时荧光定量PCR法的检测靶点因缺乏特异性、灵敏度较低，重现性较差，在实践应用中存在困难。部分研究选择短散在重复序列Alu基因作为检测靶点(A,Jerilyn A Walker,et al."Human DNA quantitation using Alu element
‑
basedpolymerase chain reaction."Analytical Biochemistry 315.1(2003):122
‑
128.Shim,G.,et al."Pharmacokinetics and In Vivo Fate of Intra
‑
Articularly TransplantedHuman Bone Marrow
‑
Derived Clonal Mesenchymal Stem Cells."Stem Cells and Development 24.9(2014).)，该基因元件与临床前常用的动物品系存在交叉反应，造成其检测特异性较差。部分研究选取常见内参基因β
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globin、β
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actin、GAPDH等作为检测对象，其检测引物或者与临床前研究所用动物品系存在交叉反应，或者由于内参基因
拷贝数低，检测灵敏度较低。
[0006]因此，需要开发一种高效、简便、准确的检测动物体内人源细胞产品分布的方法。
技术实现思路
[0007]基于上述问题，本专利技术的目的是提供一种特异性好，灵敏度高，具有良好的重现性的用于检测动物体内人源细胞产品分布的方法。
[0008]为达到上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0009]本专利技术提供了一种检测动物体内人源细胞产品分布的方法，包括如下步骤：
[0010](1)样品采集：将人源细胞产品接种至动物体内，按需在接种后的特定时间点采集目标组织及器官样品；
[0011](2)样品制备：提取各组织器官全基因组DNA，测定DNA样品浓度，将基因组DNA样品稀释至一定浓度；
[0012](3)引物设计：以LIME1为靶基因或SEQ ID NO:4所示序列为靶序列设计qPCR检测引物，其中SEQ ID NO:4序列为：
[0013]ATCTCTCTACAGTCATCTTGTCATTCTCCCCACCTCATTCCCAGCATTTCAGGCAGAGCCTCTTCCTTCAACATCAGATTGTTTTCACCTTTGTGCCTTCACAGCTGACAGCTGTGTGTGGAAAATCCTTCCGCCAATCTTTCAGGGGTTCAATCCGTGTTTTTCATTAATGTCACAAATATCTGATTAGTGAGACCTTCTCTGTCACCCAAAATTATACACTC；
[0014](4)标准曲线制备：提取人源细胞产品基因组DNA作为标准品DNA，提取未接种过人源细胞产品的动物的基因组DNA作为空白基质DNA，使用空白基质DNA将标准品DNA稀释成不同浓度进行qPCR检测，制备标准曲线；
[0015](5)样品测定：对步骤(2)中制备所得样品DNA进行qPCR检测，通过标准曲线计算样品DNA中人源DNA组分的含量。
[0016]优选地，所述人源细胞产品选自间充质干细胞、基因修饰干细胞、免疫细胞。
[0017]优选地，所述动物选自啮齿类动物、非人灵长类动物；其中啮齿类动物进一步优选为小鼠、大鼠；非人灵长类动物进一步优选为猴。
[0018]优选地，步骤(3)中以LIME1为靶基因设计所得的qPCR检测引物核苷酸序列如下所示：
[0019]R
‑
F：SEQ ID NO:1，
[0020]R
‑
R：SEQ ID NO:2，
[0021]R
‑
P：SEQ ID NO:3。
[0022]优选地，步骤(3)中以SEQ ID NO:4所示序列为靶序列设计所得的qPCR检测引物核苷酸序列如下所示：
[0023]M
‑
F：SEQ ID NO:5，
[0024]M
‑
R：SEQ ID NO:6，
[0025]M
‑
P：SEQ ID NO:7。
[0026]优选地，所述动物为啮齿类动物时，步骤(3)中以LIME1为靶基因设计所得的qPCR检测引物核苷酸序列如下所示：
[0027]R
‑
F：SEQ ID NO:1，
[0028]R
‑
R：SEQ ID NO:2，
[0029]R
‑<本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种检测动物体内人源细胞产品分布的方法，包括以下步骤：(1)样品采集：将人源细胞产品接种至动物体内，按需在接种后的特定时间点采集目标组织及器官样品；(2)样品制备：提取各组织器官全基因组DNA，测定DNA样品浓度，将基因组DNA样品稀释至一定浓度；(3)引物设计：以LIME1为靶基因或SEQ ID NO:4所示序列为靶序列设计qPCR检测引物；(4)标准曲线制备：提取人源细胞产品基因组DNA作为标准品DNA，提取未接种过人源细胞产品的动物的基因组DNA作为空白基质DNA，使用空白基质DNA将标准品DNA稀释成不同浓度进行qPCR检测，制备标准曲线；(5)样品测定：对步骤(2)中制备所得样品DNA进行qPCR检测，通过标准曲线计算样品DNA中人源DNA组分的含量。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述人源细胞产品为间充质干细胞、基因修饰干细胞、免疫细胞。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述动物为啮齿类动物、非人灵长类动物；啮齿类动物优选为小鼠、大鼠；非人灵长类动物优选为猴。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中以LIME1为靶基因设计所得的qPCR检测引物核苷酸序列如下所示：R
‑
F：SEQ ID NO:1，R
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R：SEQ ID NO:2，R
‑
P：SEQ ID NO:3。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中以SEQ ID NO:4所示序列为靶序列设计所得的qPCR检测引物核苷酸序列如下所示：M
‑
F：SEQ ID NO:5，M
‑
R：SEQ ID NO:6，M
‑
P：SEQ ID NO:7。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述动物为啮齿类动物，优选为大鼠或小鼠；步骤(3)中以LI...
【专利技术属性】
技术研发人员：李薇，闫凤英，张臣，慈小燕，
申请(专利权)人：天津和创生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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