本发明专利技术提供了一种基于荧光点亮型RNA适配体的双信号无标记放大策略的RNA剪接变异体检测方法，能够高特异性地识别目标RNA剪接位点，经过退火及在T4DNA连接酶的作用下将两探针连接起来，并与靶标结合形成完整双链结构；加入引物后可启动PCR反应，扩增出双链转录模板，实现信号的一次放大；进而转录出荧光RNA适配体Broccoli，加入可与之特异性结合的染料，从而实现信号的二次放大及荧光信号的点亮；最后可通过酶标仪荧光检测系统对目标RNA剪接变异体进行检测定量。本发明专利技术简便可控，具有特异性强、灵敏度高、序列无需标记及背景信号低等优点，能够定量检测临床样本中的低丰度RNA剪接变异体，具有广阔的应用前景。具有广阔的应用前景。具有广阔的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
一种基于荧光点亮型RNA适配体的双信号无标记放大策略的RNA剪接变异体检测方法
[0001]本专利技术涉及核酸检测领域，具体为一种基于荧光点亮型RNA适配体的双信号无标记放大策略的RNA剪接变异体检测方法。
技术介绍
[0002]RNA剪接是真核生物基因表达过程中非常关键的环节，它影响着基因的选择和组成，并直接指导蛋白质的合成，因此也间接决定了生物体的生长发育性状和功能。据统计，95％的人类基因都存在mRNA选择性剪接过程，异常的剪接会引起很多疾病的发生，如癌症、神经退役性疾病、自身免疫性疾病等。由于RNA剪接发生在基因表达的早期并且不会改变基因组，因此成为疾病治疗有利的干预点。要想正确解码人类基因组和其他哺乳动物基因组所包含的生命活动信息以及相关的疾病机制，全面和深入的了解RNA剪接过程极为重要。因此，实现对低表达和序列同源性较高的RNA剪接变异体的定量检测是一项重要挑战。
[0003]凝胶电泳分析技术是体外判断RNA剪接效率的金标准。尽管凝胶电泳在生物实验中广泛应用，但是其相对荧光检测技术通量较低，并且需要放射性同位素标记，不仅耗时费力，同时在操作方面也存在安全隐患。微阵列技术具有高通量、高扩增能力等优点，但所需设备和材料昂贵，操作相对复杂，从而限制了大范围的应用。除此之外，传统的反转录聚合酶链式反应(RT
‑
PCR)通常需要设计外显子拼接位置序列为杂交的引物，这种引物5
’
端或3
’
端与另一种剪接体亚型部分匹配可能会导致错误的扩增，且RT
‑
PCR的方法不能识别特定序列(Exon
‑
Exon序列)，这使得同种型RNA剪接变异体的检测具有较大挑战性。
[0004]针对上述问题，开发一种可以定量检测RNA剪接变异体的低成本、高灵敏分析方法对于后续研究具有重要意义。荧光RNA适配体是经体外筛选得到的RNA序列，可以高特异性的与其同源荧光染料结合并显著激活其荧光，具有检测灵敏、背景信号低及荧光开启率高等优点，荧光RNA适体的出现为RNA检测提供了有利的工具。除此之外，荧光RNA适配体的分子质量相对较小，易于修饰，成本较低，在RNA检测领域展现出不凡的应用前景。本专利技术将荧光点亮型RNA适配体与连接依赖性识别及PCR扩增技术相结合，利用荧光RNA适配体低背景信号、高灵敏检测，连接识别的高特异性和PCR高效扩增的优势，期望实现对目标RNA剪接变异体的精准靶向及灵敏检测。
技术实现思路
[0005]为了克服现有技术中存在的不足，本专利技术提供了一种基于荧光点亮型RNA适配体的双信号无标记放大策略的RNA剪接变异体检测方法。本方法针对靶标MyD88
L
，设计了两条可精准靶向RNA剪接变异体序列的探针，称为探针A和探针B，经过退火及在T4 DNA连接酶的作用下将靶标与探针连接成完整双链结构，加入所需引物启动PCR扩增反应，实现信号一次放大的同时形成转录模板，进而在T7启动子的驱使下转录出荧光RNA适配体Broccoli，加入可与之特异性结合的染料DFHBI
‑
1T，从而实现信号的二次放大，最后可通过酶标仪荧光检
测系统对靶标序列进行检测及定量。该策略具有特异性强、灵敏度高、序列无需标记及背景信号低等特点，能够定量检测临床样本中的低丰度RNA剪接变异体，在疾病的精确诊断和辅助临床监测等方面具有广阔的应用前景。
[0006]一种基于荧光点亮型RNA适配体的双信号无标记放大策略的RNA剪接变异体检测方法，具体方案如下：
[0007](1)设计可特异性结合目标RNA剪接变异体的探针A和探针B，及可触发PCR反应的正、反引物；
[0008](2)加入T4多聚核苷酸激酶、ATP、T4多聚核苷酸激酶缓冲液，将探针A进行5
’
端磷酸化，便于和探针B连接形成长链；
[0009](3)探针A和探针B与靶标进行退火，在T4 DNA连接酶的作用下，探针A、B被连接成长链，并与目标RNA剪接变异体形成完整双链结构；
[0010](4)加入Taq DNA聚合酶及扩增所需引物，通过PCR反应实现信号的一次放大，同时扩增出双链转录模版；
[0011](5)加入T7 RNA聚合酶、rNTPs，触发RNA转录过程，产生荧光RNA适配体Broccoli，实现信号的二次放大；
[0012](6)将转录得到的荧光RNA适配体Broccoli与特定染料DFHBI
‑
1T结合，进而开启荧光信号；
[0013](7)通过酶标仪荧光检测系统对靶标序列进行检测，实现目标RNA剪接变异体的定量分析。
[0014]以下内容是对上述方案中技术路线的补充：
[0015]1.本专利技术针对的靶标是MyD88
L
，序列(5
’‑3’
)为：CCAGC ATTGA GGAGG ATTGC CAAAA GTATA，设计的探针A和探针B可以特异性靶向目标RNA剪接变异体的拼接位点，探针A序列(5
’‑3’
)为：CCTCC TCAAT GCTGG TTTTT TTAAC TATAC AACAT ACTAC CTCA，探针B序列(5
’‑3’
)为：GATAC AGAGC CCACA CTCTA CTCGA CAGAT ACGAA TATCT GGACC CGACC GTCTC TGTAT CCCTA TAGTG AGTCG TATTA TATAC TTTTG GCAAT，设计的正引物和反引物可辅助PCR扩增反应的进行，正引物序列(5
’‑3’
)为：TGACC TAGTA TGTCG TGTAG TC，反引物序列(5
’‑3’
)为：GATAC AGAGC CCACA CTCTA CT。
[0016]2.探针A磷酸化的条件为：在200μL离心管中，加入4μL浓度为10μM的探针A溶液、10U T4多聚核苷酸激酶、1～2μL浓度为10mM的ATP溶液、2μL T4多聚核苷酸激酶缓冲液及11μL DEPC水，37℃反应1小时，65℃反应20分钟。
[0017]3.探针与靶标退火的条件为：加入1μL浓度为200nM的目标RNA剪接变异体溶液、1～1.5μL浓度为2μM的探针A溶液、1～1.5μL浓度为2μM的探针B溶液、0.5μL T4 DNA连接缓冲液及0.5～1μL DEPC水，95℃反应3分钟，温度梯度降温至4℃。
[0018]4.探针与目标RNA剪接变异体连接的条件为：加入5U T4 DNA连接酶、1μL浓度为10mM的ATP溶液、2～3μL DEPC水，25℃反应1小时，65℃反应10分钟。
[0019]5.PCR反应的条件为：加入5U Taq聚合酶、2μL KCl缓冲液、1～1.5μL浓度为25mM的MgCl2溶液、2～3μL浓度为2mM的dNTPs溶液、1μL浓度为1μM的正引物溶液、1μL浓度为1μM的反引物溶液及10μL DE本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种基于荧光点亮型RNA适配体的双信号无标记放大策略的RNA剪接变异体检测方法，其特征在于，该检测方法包括以下步骤：(1)设计可特异性识别目标RNA拼接位点的探针A和探针B，以及可触发PCR反应的正引物和反引物；(2)加入T4多聚核苷酸激酶、ATP、T4多聚核苷酸激酶缓冲液将探针A进行5
’
端磷酸化，便于和探针B连接形成长链；(3)探针与目标RNA剪接变异体进行退火，在T4 DNA连接酶的作用下，探针A、B被连接成长链，并与靶标形成完整双链结构；(4)加入Taq DNA聚合酶及扩增所需引物，通过PCR反应实现信号的一次放大，同时扩增出双链转录模版；(5)加入T7 RNA聚合酶、rNTPs，触发RNA转录过程，产生荧光RNA适配体Broccoli，实现信号的二次放大；(6)将转录得到的荧光RNA适配体Broccoli与特定染料结合，进而开启荧光信号；(7)通过酶标仪荧光检测系统对靶标序列进行检测，从而实现RNA剪接变异体的定量分析。2.根据权利要求1所述的一种基于荧光点亮型RNA适配体的双信号无标记放大策略的RNA剪接变异体检测方法，其特征在于，步骤(1)中，针对的靶标是MyD88
L
，序列(5
’‑3’
)为：CCAGC ATTGA GGAGG ATTGC CAAAA GTATA，设计的探针A和探针B是可以特异性结合目标RNA剪接变异体的寡核苷酸序列，包含靶向序列MyD88
L
的核酸靶向区，探针A序列(5
’‑3’
)为：CCTCC TCAAT GCTGG TTTTT TTAAC TATAC AACAT ACTAC CTCA，探针B序列(5
’‑3’
)为：GATAC AGAGC CCACA CTCTA CTCGA CAGAT ACGAA TATCT GGACC CGACC GTCTC TGTAT CCCTA TAGTG AGTCG TATTA TATAC TTTTG GCAAT，设计的正引物和反引物可以辅助PCR扩增反应的进行，正引物序列(5
’‑3’
)为：TGACC TAGTA TGTCG TGTAG TC，反引物(5
’‑3’
)为：GATAC AGAGC CCACA CTCTA CT。3.根据权利要求1所述的一种基于荧光点亮型RNA适配体的双信号无标记放大策略的RNA剪接变异体检测方法，其特征在于：步骤(2)中，探针A磷酸化的条件为：在200μL离心管中，加入4μL浓度为10μM的探针A溶液、10U T4多...
【专利技术属性】
技术研发人员：任晓君，夏玉晴，马晓晨，
申请(专利权)人：北京工业大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。