用于执行数字PCR的系统和方法技术方案

本发明专利技术提供了用于定量靶核酸的系统和方法。包含靶核酸的样本分离成包含至少一个靶核酸分子的第一多个反应体积和不含靶核酸分子的第二多个反应体积。所述反应体积经受扩增测定，其中所述扩增测定配置为扩增所述靶核酸。在所述多个反应体积的至少一部分，对扩增的指标进行检测或测量。基于所述检测或测量，对所述靶核酸进行定量。在停止所述扩增测定之后，能够加热所述多个反应体积，并且能够检测或测量所述反应体积的至少一部分的所述扩增的指标的变化。标的变化。标的变化。

【技术实现步骤摘要】
用于执行数字PCR的系统和方法
[0001]本申请是申请号为201680062614.X、申请日为2016年9月29日、专利技术名称为“用于执行数字PCR的系统和方法”的专利技术专利申请的分案申请。
[0002]相关申请的交叉引用
[0003]本专利申请要求提交于2015年9月29日的美国临时专利申请号62/234,158的权益，该文献全文以引用方式并入本文。
[0004]引言
[0005]数字PCR(dPCR)是常规聚合酶链反应(PCR)方法的一种改进，可用于直接定量并克隆扩增核酸(包括DNA、cDNA、甲基化DNA、RNA等)。dPCR和传统PCR之间的一个区别在于测量核酸量的方法。在dPCR中，样本被分离为大量单独的样本体积或部分，并且在每个样本部分单独进行相应的PCR反应。这种分离允许对非常少量的核酸进行灵敏的测量。已经证明，dPCR可用于研究基因序列的变异，诸如拷贝数变异或点突变。
[0006]在dPCR中，样本被分隔，使得样本中待评估的单个核酸分子限于局部并且集中在许多分离的区域内。虽然在常规PCR中分子的起始拷贝数量与扩增循环的数量成比例，但是dPCR不依赖于测定扩增循环的次数来测定初始样本量。相反，初始样本被分隔成大量相对较小的样本部分，其中包含一个拷贝或大约一个拷贝，或者不包含核酸模板或靶标的拷贝。因此，每个分隔的样本部分的特征可在于用于包含至少一种类型的靶核酸分子的“0”或“1”，从而分别导致阴性(“0”)或阳性(“1”)PCR反应。通过这种方式分隔样本可以使用Poisson统计提供了对初始样本中分子的估算值。然而，根据产生的“0”和“1”的数量，这种估算值的准确度有所不同。
[0007]需要改善dPCR过程中获得的信息和数据以及基于此类信息的分析，以便提高由dPCR获得的结果的准确度。例如，用于区分最初包括单个样本单元的分隔的样本与那些包含多于一个样本单元的样本的技术可以提供更准确的dPCR结果。

技术实现思路

[0008]本专利技术的实施例整体涉及用于定量一种或多种核酸的系统和方法。在某些实施例中，样本或反应溶液被分离、分散或分配成与样本反应装置、流体装置、样本固持器或其他此类装置相关联的多个样本反应体积或反应位点。所述多个样本反应体积可包括第一多个样本反应体积或反应位点和第二多个样本反应体积，其中第一多个样本反应体积各自包含一个分子或大约一个分子，并且第二多个样本反应体积各自不包含靶核酸分子。所述多个样本反应体积或反应位点经受扩增测定，该扩增测定使用例如至少一种引物或一种探针或指示染料，其中扩增测定被构造成用于扩增靶核酸。在扩增测定过程中，可以检测或测量存在于任意多个样本反应体积中的靶核酸所呈现的扩增的指标。在停止扩增测定后，可以对多个样本反应体积进行进一步处理，例如加热样本反应体积并且检测或测量反应体积的指标。在一些实施例中，指标也可以在扩增测定的一个或多个循环过程中进行检测或测量。样本反应体积可以包括分离的样本(例如，核酸样本)以及用于支持扩增反应的一种或多种试剂。所述一种或多种试剂可以在将样本装载到反应体积或反应位点中之前或之后掺入到样
本中。
[0009]在某些实施例中，在扩增测定完成后，可以在多个样本反应体积的至少一部分的第一温度处对扩增的指标进行第一检测或测量，其中指标提供了扩增产物的存在和/或量的指示。任选地，在扩增测定完成后，可以在不同于第一温度的一个或多个附加温度处(例如，在高于第一温度的一个或多个温度处)对指标进行一种或多种附加检测或测量。任选地，也可以在扩增测定的一个或多个循环过程中对指标进行一种或多种检测或测量，例如在扩增的两个或更多个循环中在相同的预先确定的测定温度处进行检测或测量，其中测定温度可以高于第一温度。
[0010]以下描述中将部分阐述另外的目的、特征和/或优点，并且所述目的、特征和/或优点将部分从本说明书中显而易见，或者可通过对本专利技术和/或权利要求的实践习得。这些目的和优点中的至少一部分可通过所附权利要求书中特别指出的元件和组合来实现和获得。
[0011]应当理解，前文大体描述以及以下详细描述仅为示例性和解释性的，并不限制权利要求；相反，权利要求应当结合其全部范围(包括等同形式)来确定。
[0012]附图简略说明
[0013]本专利技术可单独通过下文具体实施方式或通过下文具体实施方式与附图的结合进行理解。所含附图用于提供对本专利技术的进一步理解，并且该附图并入以及构成本说明书的一部分。附图示出了本教导内容的一个或多个示例性实施例，并且与描述一起用于解释特定的原理和操作。
[0014]图1A示出根据本专利技术的一个实施例的一种系统。
[0015]图1B示出根据本专利技术的一个实施例用于检测靶核酸的扩增的示例性技术。
[0016]图2A
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2B示出执行扩增的示例性方法，其中包括解链阶段。
[0017]图3A
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3D示出利用检测技术执行扩增的示例性方法。
[0018]图4示出在间隔的温度处采集的例示性、假想性示例性扩增检测数据的图。
[0019]图5示出例示性、假想性示例性实时扩增检测测量的图。
[0020]图6A和图6B示出例示性、假想性示例性实时扩增检测测量的图，其中包括发射角。
[0021]图7A和图7B示出例示性、假想性示例性解链阶段检测测量的图。
[0022]图8示出例示性、假想性示例性解链阶段检测测量的散点图。
[0023]图9示出根据本文所述的各种实施例包括多个反应位点的芯片。
[0024]图10示出根据本文所述的各种实施例的计算机系统的框图。
[0025]图11示出根据本文所述的各种实施例的示例性仪器的框图。
具体实施方式
[0026]本说明书以及示出示例性实施例的附图不应视为是限制性的。在不脱离本说明书和权利要求书的范围(包括等同形式)的前提下，可以进行各种机械、组成、结构、电和操作改变。在一些情况下，未详细示出或描述众所周知的结构和技术，以免使本专利技术难以理解。两个或更多个附图中类似的标号表示相同或相似的元件。此外，参考一个实施例详细描述的元件及其相关特征可以在任何可行的情况下包括在其中没有明确示出或描述它们的其他实施例中。例如，如果一种元件参考一个实施例详细描述而没有参考第二个实施例进行描述，则该元件可以仍被声称为包括在第二个实施例中。
[0027]在本说明书和所附权利要求中，除非另有说明，否则表示数量、百分比或比例的所有数字以及在说明书和权利要求中使用的其他数值在所有情况下都应理解为使用“约”一词进行修饰(如果它们未经修饰的话)。因此，除非指明是相反情况，否则下文说明书和所附权利要求中提出的数值参数是可能根据所寻求获得的所需特性而改变的近似值。至少，而且并非试图将等同原则的适用范围限制在权利要求书的范围内，每个数值参数至少应该根据所报告有效数字的数量，通过应用普通舍入技术来解释。
[0028]应注意，除非明确地并且好不含糊地限于一个指示物，否则如本说明书和所附本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于检测和/或定量核酸的方法，所述方法包括：将包含靶核酸的样本分离在多个样本反应体积中，其中所述多个样本反应体积包括第一多个样本反应体积和第二多个样本反应体积，所述第一多个样本反应体积各自包含所述靶核酸的至少一个分子，并且所述第二多个样本反应体积各自不含所述靶核酸的分子；使所述多个样本反应体积经受扩增测定，其中所述扩增测定配置为扩增所述靶核酸；对于所述多个样本反应体积的所述样本反应体积中的至少一部分，检测或测量扩增的指标；停止所述扩增测定；并且在停止所述扩增测定后，加热所述多个样本反应体积，并且对于所述样本反应体积的所述至少一部分中的两个或更多个样本反应体积，检测或测量所述扩增的指标。2.根据权利要求1所述的方法，还包括沿反应装置的温度梯度的轴线设置所述样本反应体积。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述样本反应体积在所述加热过程中沿温度梯度设置，其中所述扩增的指标中的变化各自与温度的变化相关联，所述温度的变化对应于沿所述温度梯度的相应位置。4.根据权利要求1所述的方法，其中对于所述多个样本反应体积，检测所述扩增的指标中的变化还包括：在加热过程中，通过检测沿温度梯度的多个位置处的所述多个样本反应体积中存在的所述扩增的指标的一种或多种变化来生成所检测的数据的连续函数。5.根据权利要求1所述的方法，其中所述多个样本反应体积容纳在多个单独的反应室中。6.根据权利要求1所述的方法，还包括：基于所述变化对所述靶核酸的所述扩增进行定量。7.根据权利要求1所述的方法，其中检测所述扩增的指标的所述变化包括在所述加热过程中单个预先确定的温度或用户可选择的温度处检测所述扩增的指标的所述变化。8.根据权利要求1所述的方法，还包括：将所述扩增的指标的所述变化与温度的变化的关联起来；基于所述温度的变化，识别错误的扩增或确认预期的扩增。9.根据权利要求8所述的方法，其中识别错误的扩增还包括：将与每个变化相关联的所述温度的变化与预期的解链温度或解链温度的簇进行比较；并且基于所述比较识别所述错误的扩增。10.根据权利要求9所述的方法，其中所述预期的解链温度是基于用于扩增和所述靶核酸的所述扩增测定。11.根据权利要求9所述的方法，其中与样本反应体积的变化相关联的温度的所述变化指示存在于所述样本反应体积中的核酸分子的解链温度，并且预期的温度变化指示所述扩增测定的预期扩增子以及靶核酸分子的预期解链温度。12.根据权利要求7
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11所述的方法，其中所述温度中的每个是所述分离的样本中的一
者的温度、包含所述分离的样本的反应装置的温度或者包含所述反应装置的样本块的温度中的至少一者。13.根据权利要求1所述的方法，其中对于所述多个样本反应体积，检测所述扩增的指标中的变化还包括：在所述加热过程中以预先确定的间隔检测所述多个样本反应体积中呈现的所述扩增的指标中的一种或多种变化，其中所述一种或多种变化各自与对应于在检测到所述变化时的相应间隔的温度的变化相关联。14.根据权利要求1所述的方法，其中对于所述多个样本反应体积，检测所述扩增的指标中的变化还包括：在加热过程中，通过检测多个不同时间的所述扩增的指标中的至少一部分的一种或多种变化来生成所检测的数据的连续函数。15.根据权利要求1所述的方法，其中容纳在所述第一多个样本反应体积中的所述靶核酸的所述至少一个分子包括两种不同靶核酸、三种不同靶核酸或四种不同靶核酸中的靶核酸的至少一个分子。16.根据权利要求1所述的方法，还包括基于所述多个样本反应体积的所述扩增的指标的所述变化，对所述两种靶核酸中的每一者的所述扩增进行定量。17.用于检测和/或定量样本中的核酸的分析方法，所述方法包括：将包含靶核酸的样本分离在多个样本反应体积中，其中所述多个样本反应体积包括第一多个样本反应体积和第二多个样本反应体积，所述第一多个样本反应体积各自包含所述靶核酸的至少一个分子，并且所述第二多个样本反应体积各自不含所述靶核酸的分子；使所述多个样本反应体积经受扩增测定，其中所述扩增测定配置为扩增所述靶核酸以产生扩增产物；在所述经受扩增测定之后并且在所述样本反应体积的第一温度处，对于所述多个样本反应体积的相应的样本反应体积的扩增的指标进行第一组测量；基于所述第一组测量，检测和/或测量每个样本反应体积的所述扩增产物的量；以及以下项中的至少一者：在所述经受扩增测定的过程中进行一组所述扩增指标的附加测量，其中对于热循环过程的一个或多个循环，在预先确定的测定温度处或附近进行所述至少一组附加的测量；或者在进行所述第一组测量之后，对于所述多个样本反应体积的至少一部分，对所述扩增的指标进行至少一种扩增后测量。18.根据权利要求17所述的方法，其中所述第一温度和/或所述预先确定的测定温度为(a)所述分离的样本中的一者的温度、(b)包含所述分离的样本的反应装置的温度或者(c)包含所述反应装置的块的温度中的至少一者。19.根据权利要求17所述的方法，其中所述至少一种扩增后测量在高于所述第一温度的温度下进行。20.根据权利要求17所述的方法，其中所述扩增的指标包括所述样本反应体积的荧光。21.根据权利要求17所述的方法，其中进行所述一组附加测量还包括：将所述附加测量
中的每个与定量循环值关联起来；将与所述附加测量相关联的所述定量循环值与所述扩增测定的预期定量循环值进行比较；并且基于所述比较识别错误的扩增产物。22.根据权利要求21所述的方法，还包括：基于所述一组附加测量对所述样本中的所述靶核酸进行定量。23.根据权利要求17所述的方法，其中在扩增后温度高于所述第一温度时，进行一组附加测量还包括：基于所述一组附加测量，识别所述扩增的指标的一种或多种变化；将所述至少一种变化与扩增后温度关联起来；将与所述至少一种变化相关联的所述扩增后温度与所述靶核酸的预期解链温度或解链温度的簇进行比较；并且基于所述比较识别错误的扩增产物。24.根据权利要求23所述的方法，还包括：基于所述一组附加测量和所识别的错误的扩增产物，对所述样本中的所述靶核酸进行定量。25.根据权利要求17所述的方法，其中在所述扩增后温度高于所述第一温度时，对所述多个样本反应体积的至少一部分的所述扩增的指标进行至少一种其他测量，还包括：在不同的扩增后温度下，对所述多个样本反应体积的至少一部分的所述扩增的指标进行多种其他测量，其中所述扩增后温度高于所述第一温度；基于所述测量，识别所述扩增的指标的多种变化；将所识别的变化中的每一者与扩增后温度关联起来；将与所述变化的每一者相关联的所述扩增后温度与所述靶核酸的预期温度进行比较；基于所述比较识别错误的扩增产物；并且基于对所述扩增的所述指标的测量和所识别的错误的扩增产物，对所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：D，
申请(专利权)人：生命技术公司，
类型：发明
国别省市：