冷冻胚胎的复苏、培养、优选和单囊胚移植方法以及用于复苏冷冻胚胎的无创检测方法技术

本发明专利技术提供了用于复苏冷冻胚胎的无创检测方法，以及用于获取检测样本的冷冻胚胎的复苏、培养方法，本发明专利技术还提供了利用检测结果评估胚胎移植优先等级的胚胎优选方法，用于单囊胚移植当中，从而本发明专利技术还提供了相应的单囊胚移植方法和系统。移植方法和系统。移植方法和系统。

【技术实现步骤摘要】
冷冻胚胎的复苏、培养、优选和单囊胚移植方法以及用于复苏冷冻胚胎的无创检测方法


[0001]本专利技术属于辅助生殖
具体地，本专利技术涉及一种在体外受精
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胚胎移植技术中应用于胚胎冷冻/复苏的一系列方法，包括用于复苏冷冻胚胎的无创检测方法，以及用于获取检测样本的冷冻胚胎的复苏、培养方法，还包括利用检测结果评估胚胎移植优先等级的胚胎优选方法，以及相应的单囊胚移植方法和系统。

技术介绍

[0002]体外受精
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胚胎转移技术(IVF
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ET)是怀孕困难夫妻孕育后代的最终解决方案之一。迄今为止，全球已有超过800万的婴儿是借助IVF
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ET技术出生。在此过程中，由于胚胎移植时，一般会尝试多胚胎移植，使得多胎妊娠率居高不下，目前已达到20％。多胎妊娠会增加不良妊娠结局并危及母婴健康，选择性单囊胚移植(eSET)是降低多胎妊娠率的最有效方法，在国际上得到越来越多的应用。在这样的趋势下，提高单胚胎移植的成功率至关重要，但目前仍然欠缺科学的胚胎发育潜能的评价方法。
[0003]染色体非整倍体会导致胚胎发育停滞或胚胎着床失败，是导致IVF妊娠率低下、流产率较高的一个重要因素。在流产胎儿中，非整倍体占比达50％以上。现阶段最常用的胚胎选择方法是传统的形态学评估，但其无法单独识别胚胎的染色体情况。因此，可以对于染色体非整倍体的高风险人群实施胚胎植入前遗传学非整倍体检测技术(preimplantation genetic testing foraneuploidy，PGT
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A)，在植入前对胚胎染色体进行拷贝数分析。但如果待孕者未能在首个周期选择PGT
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A，若发生种植失败或流产，只能继续通过形态学评级对剩余的冻存胚胎进行选择，无法确认染色体情况。
[0004]如果这部分人群在移植失败或流产后，计划选择PGT
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A检测，则需要在经历胚胎复苏后，再实施有创的胚胎活检和二次冷冻等一系列操作，可能使胚胎受损。因此，针对此类人群，若能通过无创染色体筛查，检测胚胎的染色体倍性，可在复苏后避免胚胎的活检操作，极大的减少胚胎受损的可能。
[0005]胚胎在培养过程中会释放cfDNA到培养液中，近些年，通过cfDNA进行无创PGT
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A检测成为辅助生殖领域的研究热点。特别是对冷冻后复苏胚胎的培养液进行的相关研究表明，与新鲜胚胎培养液相比，冻胚培养液被证明更适合实施无创胚胎植入前遗传学非整倍体检测(niPGT)。研究通常在冻胚复苏后，培养14
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24h，收集培养液或者囊胚腔液和培养液混合液，样本扩增成功率为92.3
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100％，以整胚的结果为金标准，对比培养液结果与整胚结果的一致性，准确性可达 87
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100％。Kuznyetsov等人的研究结果显示，NICS结果与整胚结果的一致性甚至超过TE结果与整胚结果的一致性(96.4％vs 87.5％)。但是，通常在冷冻复苏周期中，以上研究的冻胚复苏培养时间均较长(14
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24h)，这对于已经达到冷冻标准的冻存囊胚来说，体外培养时间过长，则错过胚胎种植的最佳时机，并不适合在实际临床工作中应用。
[0006]目前，临床上常规地会在胚胎发育的第5至第7天(囊胚阶段)，对胚胎进行形态学
评级，选择级别为3BC以上的囊胚进行冷冻，并在冷冻前进行激光皱缩。胚胎冷冻多采用玻璃化冷冻技术，临床使用较多的载体是cryoleaf、cryotop、冷冻环cryoloop。冷冻液和解冻液均购买商业化产品，如日本加藤公司。囊胚冷冻的过程是：平衡和洗涤囊胚，然后装管并装载，投入液氮冷冻。在复苏时，把囊胚进行平衡、洗涤和培养。囊胚在复苏2小时后囊胚腔扩张，则表明复苏成功。大部分中心培养2
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3小时后直接移植囊胚。个别中心会过夜培养(18
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20h)，再把胚胎移植到患者体内。个别中心会对胚胎活检，再次冷冻胚胎，待活检结果出来后，复苏整倍体的胚胎进行移植。
[0007]本专利技术提供了一种改进的胚胎复苏培养方式，对冷冻囊胚进行检测、培养和评估。
[0008]专利技术简述
[0009]本专利技术的专利技术人通过长期经验积累和研究验证，探索出了一系列应用于胚胎冷冻/复苏的操作条件和/或检测评估方法，以最大限度增加冷冻胚胎移植的成功率，以保证接受冷冻胚胎移植的待孕者获得最佳结局。
[0010]在一个方面，本专利技术提供了一种冷冻胚胎的复苏方法，所述方法包括：(1)获取准备复苏的来自待孕者的冷冻胚胎；(2)复苏所述冷冻胚胎，并转入微滴培养体系进行培养，培养时间为T1。
[0011]在一个更具体的实施方案中，所述T1为4
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10小时，优选6
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8小时，更优选6小时。
[0012]在另一个优选的实施方案中，所述微滴培养体系的体积为10
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20μL，优选15μL，更优选10 μL。
[0013]在第二个方面，本专利技术提供了一种冷冻胚胎复苏后的检测样本制备方法，其中所述的检测样本是用于胚胎的基因/染色体检测，例如整倍性检测，所述方法的特征在于，采用本专利技术第一方面的复苏方法对胚胎进行复苏和培养，并在培养结束后，获取所述培养体系中的培养液作为检测样本。
[0014]在一个具体的实施方案中，培养时间为4
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10小时，优选6
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8小时，更优选6小时。在另一个优选的实施方案中，所述微滴培养体系的体积为10
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20μL，优选15μL，更优选10μL。
[0015]在第三个方面，本专利技术提供了一种冷冻胚胎复苏后的基因/染色体检测方法，以检测胚胎在基因/染色体方面是否具有异常状况，例如，染色体的整倍性/非整倍性。所述方法的特征在于，采用本专利技术第一方面的复苏方法对胚胎进行复苏和培养，并采用本专利技术第二方面的检测样本制备方法获得检测样本。
[0016]在一个优选的实施方案中，所述胚胎基因/染色体检测方法是无创胚胎染色体筛查(non
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invasive chromosome screening,NICS)。
[0017]在一个具体的实施方案中，培养时间为4
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10小时，优选6
‑
8小时，更优选6小时。在另一个优选的实施方案中，所述微滴培养体系的体积为10
‑
20μL，优选15μL，更优选10μL。
[0018]在一些实施方案中，所述基因/染色体检测方法的检测结果是，样本中来自胚胎的游离DNA 经检测为具有整倍性，因而所述胚胎的染色体是整倍体。在另一些实施方案中，所述检测的结果是，样本中来自胚胎的游离DNA经检测为具有非整倍性，因而所述胚胎的染色体是非整倍体，例如，21
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三体，18
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三体，等等。在另一些实施方案中，所述检测的结果是，样本中来自胚本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种评定冷冻胚胎移植优先等级的方法，包括以下步骤：(1)获取来自待孕者的冷冻胚胎；(2)复苏所述冷冻胚胎，并转入微滴培养体系进行培养，其中所述培养时间为T1；(3)收集培养液，对其中的cfDNA进行扩增后进行胚胎染色体遗传学检测；(4)根据染色体遗传学检测和胚胎冷冻之前进行的形态学评估的结果对胚胎进行移植优先等级评定。2.如权利要求1所述的方法，其中微滴培养体系的体积为10μL
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20μL。3.如权利要求1所述的方法，其中培养时间T1为4
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10小时。4.如权利要求1所述的方法，其中培养时间T1为6
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8小时。5.如权利要求1
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4任一项所述的方法，其中染色体遗传学检测分为三种结果：整倍体、NA和非整倍体；形态学评估分为三种结果：优、中和差；根据上述结果评定胚胎移植的优先等级为：整倍体+优>NA+优>整倍体+中>NA+中，而染色体遗传学检测为非整倍体的和/或形态学评估为差的胚胎在患者充分知情风险的情况下，由临床医生与患者共同决定是否移植。6.一种优选冷冻胚胎的方法，包括步骤：采用权利要求1
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5任一项的方法对候选胚胎进行移植优先等级评定；其特征在于，选择优先等级最高的胚胎，将以在候选胚胎中最大概率获得最佳临床结局，即持续妊娠并活产。7.一种冷冻胚胎移植的方法，包括以下步骤：(1)获取准备复苏的来自待孕者的冷冻胚胎；(2)复苏所述冷冻胚胎，并转入微滴培养体系进行培养，其中所述培养时间为T1；(3)收集培养液，对其中的cfDNA进行扩增后进行胚胎染色体遗传学检测；(4)根据染色体遗传学检测和胚胎冷冻之前进行的形态学评估的结果对胚胎进行优先等级评定；(5)向待孕者移植优先等级更高的胚胎。8.如权利要求7所述的方法，其中微滴培养体系的体积为10
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20μL。9.如权利要求7所述的方法，其中培养时间T1为4
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10小时。10.如权利要求7所述的方法，其中培养时间T1为6
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8小时。11.如权利要求7
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10任一项所述的方法，其中染色体遗传学检测分为三种结果：整倍体、NA和非整倍体；形态学评估分为三种结果：优、中和差；由上述结果评定胚胎移植的优先等级为：整倍体+优>NA+优>整倍体+中>NA+中，而染色体遗传学检测为非整倍体的和/或形态学评估为差的胚胎在患者充分知情风险的情况下，由临床医生与患者共同决定是否移植。12.如权利要求11所述的方法，其中所述方法将以在候选胚胎中最大概率获得最佳临床结局，即持续妊娠并活产。13.一种冷冻胚胎复苏方法，包括以下步骤：a)获取准备复苏的来自待孕者的冷冻胚胎；b)复苏所述冷冻胚胎，并转入微滴培养体系进行培养，培...

【专利技术属性】
技术研发人员：姚雅馨，王静，赵敦梅，万安琪，任军，
申请(专利权)人：序康医疗科技苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：