一种高效获得T－DNA插入侧翼序列的方法及其应用技术

本发明专利技术涉及Transfer DNA(T‑DNA)插入真核生物基因组后，其相关插入位点侧翼序列信息获得的方法及其应用，属于生物技术研究领域。本发明专利技术在双元质粒T‑DNA区域的左边界(Left Border)或者右边界(Right Border)附近设计一条生物素标记的特异引物；利用该引物可以同时结合靶标序列片段以及链霉亲和素的特性，将含有T‑DNA插入的边界核酸序列分离并纯化；接着将一个已知序列的接头连接到纯化片段的5’端，并进行PCR扩增；最后将PCR序列克隆至载体测序，获得插入序列信息。和传统的iPCR和TAIL‑PCR相比，该方法可以显著提高鉴定T‑DNA插入位点的效率和准确率。

A highly efficient method for obtaining t DNA inserting flanking sequences and its application

The invention relates to the method and application of Transfer DNA (T DNA) inserted into the eukaryotic genome, and the application of the related inserting site flanking sequence information, which belongs to the field of biotechnology research. The present invention designs a specific primer for biotin labeling near the left boundary (Left Border) or the right boundary (Right Border) in the dual plasmid T DNA region, which can be used to separate and purify the boundary nucleic acid sequences containing the T inserted DNA in the sequence of the target sequence and the characteristics of the streptomycin; then the primers will be separated and purified. The joint of a known sequence was connected to the 5 'end of the purified fragment and amplified by PCR; finally, the sequence of the PCR sequence was cloned to the carrier, and the information of the insertion sequence was obtained. Compared with the traditional iPCR and TAIL PCR, this method can significantly improve the efficiency and accuracy of identifying T DNA insertion sites.

【技术实现步骤摘要】
一种高效获得T-DNA插入侧翼序列的方法及其应用
本专利技术涉及TransferDNA(T-DNA)插入真核生物基因组后，其相关插入位点侧翼序列信息获得的方法及其应用，属于生物技术研究领域。
技术介绍
根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)能将其细胞内携带的Ti质粒(Tumorinducingplasmid)上的一段特殊序列，即转移DNA(transferDNA，简称T-DNA)，随机整合至受体植物或真菌的基因组中，最终诱发受体细胞产生基因突变或者产生转基因细胞系。目前，对于一部分植物和真菌，利用T-DNA基因组随机插入法鉴定基因的生物学功能已经比较成熟。科研人员利用常见的iPCR法(inversePolymeraseChainReaction)以及TAILPCR法(ThermalasymmetricinterlacedPCR)获取T-DNA插入位点的侧翼序列(即T-DNA插入基因组的位置)，然后结合已知的相关物种的基因组信息，便可以获得对应的转基因品系或菌株中哪些功能基因被突变。但是，上述iPCR法和TAIL-PCR法也存在局限性，它们由于过分依赖PCR，导本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高效获得TransferDNA(T‑DNA)插入基因组DNA位点侧翼序列的方法，其技术特征如下：A.在双元质粒T‑DNA区域的左边界(Left Border)或者右边界(Right Border)附近设计一条生物素标记的特异引物；B.合成一条引物，其序列和上述生物素标记的引物序列必须反向互补；C.合成一条双链DNA接头，该接头的5’端为平末端，3’端为一个T碱基突出的粘性末端；D.合成一对Polymerase Chain Reaction(PCR)引物，上游引物序列为部分接头序列，下游引物序列为T‑DNA的靠近Left Border或者Right Border的序列，且必须在生物素标记引物...

【技术特征摘要】
1.一种高效获得TransferDNA(T-DNA)插入基因组DNA位点侧翼序列的方法，其技术特征如下：A.在双元质粒T-DNA区域的左边界(LeftBorder)或者右边界(RightBorder)附近设计一条生物素标记的特异引物；B.合成一条引物，其序列和上述生物素标记的引物序列必须反向互补；C.合成一条双链DNA接头，该接头的5’端为平末端，3’端为一个T碱基突出的粘性末端；D.合成一对PolymeraseChainReaction(PCR)引物，上游引物序列为部分接头序列，下游引物序列为T-DNA的靠近LeftBorder或者RightBorder的序列，且必须在生物素标记引物位点和LeftBorder(或者RightBorder)序列之间；E.将目的基因组DNA用超声波破碎仪随机打断，片段大小在400-1000bp之间；F.上述破碎后的基因组DNA为模板，依次加入生物素标记的引物，PCR反应所必须的组分，进行1个循环的PCR扩增；G.扩增期间，在PC...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓晟，林玲，张昕，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：江苏,32