一种蛇胆汁的鉴别方法技术

本发明专利技术公开了一种蛇胆汁的鉴别方法，该方法通过找出蛇类胆汁的特异性DNA片段，设计出特异性引物，通过PCR技术，扩增出蛇胆汁的特异性cytb片段，以对其他动物的胆汁进行区分，快速有效地鉴别出蛇胆汁的真伪。本发明专利技术的鉴别方法操作简单，重复性好准确度高，能有效地控制蛇胆汁的质量，为合理地使用蛇胆汁提供科学依据。

【技术实现步骤摘要】
一种蛇胆汁的鉴别方法
本专利技术涉及中医药
，具体是一种蛇胆汁的鉴别方法。
技术介绍
蛇胆首载于《名医别录》，为蚺蛇胆和蝮蛇胆，《本草纲目》列于鳞部第四十三卷鳞之二蛇类项下，并增收了乌蛇胆和鳞蛇胆。《中国药典》20L5年版四部收载蛇胆汁为眼镜蛇科、游蛇科或蝰科动物多种蛇的胆汁，但目前药用来源的蛇胆远远超出以上范围。由于蛇胆具有独特的药用价值，加上市场需求量大，自然资源递减，市场上含蛇胆的中药制剂较多，常见的有蛇胆川贝散、蛇胆川贝液、蛇胆追风丸、蛇胆川贝枇杷膏等。市场上蛇胆的伪品时有发现，报道的掺假物有鸡、鸭、鱼、猪、牛等动物胆汁和淀粉糊、青菜汁、明胶液、色素以及熟地黄提取液等，以及油胆(用机油刺激蛇鼻腔或蛇体，使胆汁增多而质差)或蜜胆或将蛇胆多次浸泡，再把蛇胆与酒液分别销售使胆汁稀薄质差。多年来，国内外研究者一直致力于运用各种分析方法进行蛇胆的质量控制研究。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供了一种蛇胆汁的鉴别方法，拟建立一种通过PCR方法鉴别出蛇胆汁及其他掺假动物胆汁的检验方法，以达到快速有效的鉴别出蛇胆汁的真伪，在药用上能正确地鉴别蛇胆汁，从源头上控制药品质量和保障用药安全。本专利技术所述蛇胆汁的鉴别方法包括以下步骤：（1）活蛇宰杀取蛇胆，按重量比1:1保存于体积浓度为50%的乙醇中；（2）模板DNA提取：1）取样品500μL，置1.5mL离心管中，氮气吹干，按血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒操作提取：加入缓冲液GA200µL，蛋白酶K（20mg/mL）20µL，RNA酶溶液6µL，在56℃水浴保温30分钟，加入缓冲液GB200µL，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，简短离心，把瓶盖和瓶壁上的液珠甩下来，加入无水乙醇200µL，充分混匀，简短离心，把瓶盖和瓶壁上的液珠甩下来，将所得的溶液和沉淀加到DNA纯化柱中，离心（转速为每分钟12000转）30秒；弃去过滤液，加入缓冲液GD500µL，离心（转速为每分钟12000转）1分钟，弃去过滤液，再加入洗脱液PW600µL反复洗脱2次，每次离心（转速为每分钟12000转）1分钟，弃去过滤液，再离心2分钟，将DNA纯化柱室温放置5分钟，彻底晾干，再转移入另一离心管中，加入TE或无菌双蒸水100µL，室温放置5分钟后，离心（转速为每分钟12000转）2分钟，取洗脱液，作为供试品溶液，置-20℃保存备用。2）取蛇胆汁对照药材50mg，加入缓冲液GA200µL，蛋白酶K（20mg/mL）20µL，RNA酶溶液6µL，在56℃水浴保温30分钟，加入缓冲液GB200µL，混匀，70℃放置10分钟，离心（转速为每分钟12000转）2分钟，取上清液至新离心管中，加入无水乙醇200µL，充分混匀，简短离心，把瓶盖和瓶壁上的液珠甩下来，将所得的溶液和沉淀加到DNA纯化柱中，离心（转速为每分钟12000转）30秒；弃去过滤液，加入缓冲液GD500µL，离心（转速为每分钟12000转）1分钟，弃去过滤液，再加入洗脱液PW600µL反复洗脱2次，每次离心（转速为每分钟12000转）1分钟，弃去过滤液，再离心2分钟，将DNA纯化柱室温放置5分钟，彻底晾干，再转移入另一离心管中，加入TE或无菌双蒸水100µL，室温放置5分钟后，离心（转速为每分钟12000转）2分钟，取洗脱液，作为对照药材模板DNA溶液，置-20℃保存备用。（3）PCR反应：L）鉴别引物：5´AGGACAAATATCRTTCTGAGC3´和5´ARAARTTTTCTGGGTCRTTAAA3´；2）PCR反应体系：在200µL离心管中进行，反应总体积为20µL，反应体系包括10☓PCR缓冲液2.0µL，dNTP（2.5mmol/L）0.6µL，鉴别引物（10µmol/L）各0.5µL，高保真TaqDNA聚合酶（5U/µL）0.5µL，模板1µL，无菌双蒸水14.9µL；3）将离心管置于PCR仪，PCR反应参数：95℃预变性3分钟，循环反应35次（95℃30秒，58℃30秒，72℃30秒），延伸（72℃）7分钟。（4）电泳检测：L）照琼脂糖凝胶电泳法，胶浓度为1.5%，胶中加入核酸凝胶染色剂GeLRed；供试品与对照药材PCR反应溶液的上样量分别为3～5µL，DNA分子量标记上样量为2µL（0.5µg/µL）；2）电泳结束后，取凝胶片在凝胶成像仪上或紫外透射仪上检视。供试品凝胶电泳图谱中，在与对照药材凝胶电泳图谱相应的位置上，在250～500bp应有单一DNA条带。空白对照无条带。本专利技术的有益效果是：本专利技术通过找出蛇类胆汁的特异性DNA片段，设计出特异性引物，再通过PCR技术，扩增出蛇胆汁的特异性cytb片段，以对其他动物的胆汁进行区分。通过建立蛇胆汁类的PCR鉴定方法，能够有效地对蛇胆汁和其他动物类胆汁进行真伪鉴定，有利于从源头上控制药品质量和保障用药安全。本专利技术的鉴别方法操作简单，重复性好准确度高，能有效地控制蛇胆汁的质量，为合理地使用蛇胆汁提供科学依据。附图说明图1为引物cytb158℃蛇胆汁样品验证扩增电泳图，图中1表示空白对照，2表示蛇胆汁对照药材，3表示狗胆汁，4表示猪胆汁，5表示羊胆汁，6表示牛胆汁，7表示草鱼胆汁，8表示鸭胆汁，9表示鸡胆汁，10表示蟒蛇胆汁，11表示赤链蛇胆汁，12表示蝰蛇胆汁，13表示玉斑水蛇胆汁，14表示铅色水蛇胆汁，15表示蝮蛇胆汁，16表示蕲蛇胆汁，17表示眼镜蛇胆汁，18表示水赤链蛇胆汁，19表示黑眉水蛇胆汁，20表示王锦蛇胆汁，21表示百花锦蛇胆汁，22表示三索锦蛇胆汁，23表示眼镜王蛇胆汁，24表示金环蛇胆汁，25表示银环蛇胆汁，26表示滑鼠蛇胆汁，27表示乌梢蛇胆汁，28表示金边水蛇胆汁，29表示灰鼠蛇胆汁，30表示2000DNAmarker；图2为引物cytb158℃混合胆汁扩增电泳图，图中1表示10000DNAmarker，2表示混合蛇胆汁基因组1，3表示混合蛇胆汁基因组2，4表示混合蛇胆汁基因组3，5表示混合蛇胆汁基因组4，6表示混合蛇胆汁基因组5，7表示空白对照。具体实施方式为了更加详细的介绍本专利技术，下面结合实施例，对本专利技术做进一步说明。实施例1一种蛇胆汁的鉴别方法，方法包括以下内容：1、仪器与试药：（1）蛇胆汁材料：蛇类样品收集自广东、广西等地区的20种活蛇宰杀取蛇胆，按重量比1:1保存于体积浓度为50%的乙醇中，其他7种非蛇类动物的胆从广西南宁市菜市场购买。蛇类样品由广西食品药品检验所黄清泉主管药师鉴定，凭证标本保存于广西食品药品检验所标本室，见表1表1试验材料Table1Sourceofmaterials（2）仪器：S1000型PCR扩增仪(AppliedBiosystem公司)；EppendorfMastercycler®nexusgradient；电泳仪（BIO-RAD）；微量紫外分光光度计(NanoValuePLUS)；GelDocXR+全自动凝胶成像系统(BIO-RAD)；ME203电子天平(Mettle)；MIKRO220R型高速冷冻离心机（Hettich）；漩涡震荡仪(Scientificin-dustries公司)。（3）试剂：琼脂糖购自BIOWEST公司；GelRed购自BIOTIUM公司；rTaqDNA聚合酶、DL2000DNA本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蛇胆汁的鉴别方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：（1）样品制备：活蛇宰杀取蛇胆，按重量比1:1保存于体积浓度为50%的乙醇中；（2）模板DNA提取：1）取样品500μL，置1.5mL离心管中，氮气吹干，按血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒操作提取：加入缓冲液GA 200µL，蛋白酶K20µL，RNA酶溶液6µL，在56℃水浴保温30分钟，加入缓冲液GB 200µL，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，简短离心，加入无水乙醇200µL，充分混匀，简短离心，将所得的溶液和沉淀加到DNA纯化柱中，离心30秒；弃去过滤液，加入缓冲液GD 500µL，以12000转/分钟离心1分钟，弃去过滤液，再加入洗脱液PW 600µL反复洗脱2次，每次以12000转/分钟离心1分钟，弃去过滤液，再以12000转/分钟离心2分钟，将DNA纯化柱室温放置5分钟，彻底晾干，再转移入另一离心管中，加入TE或无菌双蒸水100µL，室温放置5分钟后，以12000转/分钟离心2分钟，取洗脱液，作为供试品溶液，置‑20℃保存备用；2）取蛇胆汁对照药材50mg，加入缓冲液GA 200µL，蛋白酶K20µL，RNA酶溶液6µL，在56℃水浴保温30分钟，加入缓冲液GB 200µL，混匀，70℃放置10分钟，以12000转/分钟离心2分钟，取上清液至新离心管中，加入无水乙醇200µL，充分混匀，简短离心，将所得的溶液和沉淀加到DNA纯化柱中，以12000转/分钟离心30秒；弃去过滤液，加入缓冲液GD 500µL，以12000转/分钟离心1分钟，弃去过滤液，再加入洗脱液PW 600µL反复洗脱2次，每次以12000转/分钟离心1分钟，弃去过滤液，再离心2分钟，将DNA纯化柱室温放置5分钟，彻底晾干，再转移入另一离心管中，加入TE或无菌双蒸水100µL，室温放置5分钟后，以12000转/分钟离心2分钟，取洗脱液，作为对照药材模板DNA溶液；置‑20℃保存备用；（3）PCR反应：1）鉴别引物：5´AGGACAAATATCRTTCTGAGC 3´和5´ARAARTTTTCTGGGTCRTTAAA 3´；2）PCR反应体系：在200µL离心管中进行，反应总体积为 20µL，反应体系包括10☓PCR缓冲液2.0µL，浓度为2.5mmol/L 的dNTP 0.6µL，浓度为10µmol/L鉴别引物各0.5µL，浓度为5U/µL的高保真Taq DNA聚合酶0.5µL，模板1µL，无菌双蒸水14.9µL；3）将离心管置于PCR仪，PCR反应参数：95℃预变性3分钟，将反应95℃30秒、58℃30秒和72℃30秒连续循环35次，72℃延伸7分钟；（4）电泳检测：1）照琼脂糖凝胶电泳法，胶浓度为1.5%，胶中加入核酸凝胶染色剂GeLRed；供试品与对照药材PCR反应溶液的上样量分别为3～5µL，DNA分子量标记上样量为2µL，浓度为0.5µg/µL；2）电泳结束后，取凝胶片在凝胶成像仪上或紫外透射仪上检视。...

【技术特征摘要】
1.一种蛇胆汁的鉴别方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：（1）样品制备：活蛇宰杀取蛇胆，按重量比1:1保存于体积浓度为50%的乙醇中；（2）模板DNA提取：1）取样品500μL，置1.5mL离心管中，氮气吹干，按血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒操作提取：加入缓冲液GA200µL，蛋白酶K20µL，RNA酶溶液6µL，在56℃水浴保温30分钟，加入缓冲液GB200µL，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，简短离心，加入无水乙醇200µL，充分混匀，简短离心，将所得的溶液和沉淀加到DNA纯化柱中，离心30秒；弃去过滤液，加入缓冲液GD500µL，以12000转/分钟离心1分钟，弃去过滤液，再加入洗脱液PW600µL反复洗脱2次，每次以12000转/分钟离心1分钟，弃去过滤液，再以12000转/分钟离心2分钟，将DNA纯化柱室温放置5分钟，彻底晾干，再转移入另一离心管中，加入TE或无菌双蒸水100µL，室温放置5分钟后，以12000转/分钟离心2分钟，取洗脱液，作为供试品溶液，置-20℃保存备用；2）取蛇胆汁对照药材50mg，加入缓冲液GA200µL，蛋白酶K20µL，RNA酶溶液6µL，在56℃水浴保温30分钟，加入缓冲液GB200µL，混匀，70℃放置10分钟，以12000转/分钟离心2分钟，取上清液至新离心管中，加入无水乙醇200µL，充分混匀，简短离心，将所得的溶液和沉淀加到DNA纯化柱中，以12000转/...

【专利技术属性】
技术研发人员：张涛，罗轶，吴桂凡，黄莉莉，李立，陆游，朱雪妍，
申请(专利权)人：广西壮族自治区食品药品检验所，
类型：发明
国别省市：广西,45