肝素活性测定试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种肝素活性测定试剂盒，其包含试剂R1和试剂R2；所述试剂R1包含发色底物及缓冲液，所述试剂R2包含甘氨酸、乳酸锂、谷氨酸钠、Xa因子(Fxa)及缓冲液。与传统肝素测定试剂盒相比，本发明专利技术的试剂盒具有显著提升的稳定性和抗干扰效果。

【技术实现步骤摘要】
肝素活性测定试剂盒
本专利技术涉及生化检验和体外诊断领域。本专利技术还涉及药物生产过程的质量控制。具体而言，本专利技术涉及测定肝素活性的试剂盒及其制备方法。
技术介绍
肝素是由二种多糖交替连接而成的多聚体，无论在体内还是体外，均具有很强的抗凝作用，临床上把它作为抗凝剂药物而广泛使用，主要用于血栓性疾病的治疗及心血管手术、血液透析、体外循环等过程的抗凝处理。肝素作为药物，其活性功能的精准检测无论对于生产过程的质量控制还是临床治疗中患者的动态监控均具有重要的意义。作为生物活性物质，其检测不能单单用化学或物理的方法，必须与生物检测法结合，目前肝素的活性测定多采用凝固法和发色底物法。凝固法操作繁琐，耗时费力，精准性很差。相对于凝固法，发色底物法具有灵敏度高，操作简便的特点且检测范围更广。凝固法原理：该试验是基于普通肝素(高度负电荷的分子)被硫酸鱼精蛋白(正电荷的蛋白)中和的原理。配备不同浓度的硫酸鱼精蛋白加入血浆中，再加入凝血酶，测量凝固时间。将凝血酶凝固时间恢复至正常的硫酸鱼精蛋白浓度就被认为是肝素的浓度，这个过程仅仅用于普通肝素。发色底物法原理：Xa因子(factorXa,FXa)是一种丝氨酸蛋白酶，位于血液凝集级联的上游，处在连接内源性和外源性激活途径共同通路的中心位置，Xa因子抑制剂既能阻断内源性凝血亦能抑制外源性凝血的发生。发色底物法利用待测样品中的肝素与抗凝血酶III(antithrombinIII,ATIII)形成复合物，促进抗凝血酶III与过量添加的Xa因子的特异性结合，抑制Xa因子活性中心，使其失去活性。剩余的Xa因子与发色底物作用，释放出显色基团pNA而显色，其颜色深浅与肝素活性成反比。利用发色底物法的原理产生了一些肝素活性测定方法。例如，专利CN103063592A公开了一种肝素活性的测定方法，建立了一种较高精准性的肝素活性测定方法，该专利主要提高了试剂灵敏度及准确性。然而上述传统测定方法仍然存在试剂稳定性，尤其是热稳定性较低的问题，本领域亟需一种具有改进的热稳定性的肝素活性测定试剂盒，以更好地适应于临床药物动态监测及生产过程控制等用途。
技术实现思路
在一个方面，本专利技术提供了一种肝素活性测定试剂盒，其包含试剂R1和试剂R2；所述试剂R1包含发色底物及缓冲液，所述试剂R2包含甘氨酸、乳酸锂、谷氨酸钠、Xa因子(Fxa)及缓冲液。在一些实施方案中，试剂R1中所述发色底物选自如下一项或多项：Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-pNA、Suc-Ile-Glu(γ-pip)-Gly-Arg-pNA·HCl、N-α-Z-D-Arg-Gly-Arg-pNA·2HCl、和Z-D-Arg-Gly-Arg-pNA·2HCl。在一个优选的实施方案中，所述发色底物为Z-D-Arg-Gly-Arg-pNA·2HCl。最优选地，所述发色底物的浓度为0.1～3.0g/L。在一些实施方案中，试剂R2中甘氨酸浓度为10.0～50g/L。在一些实施方案中，试剂R2中乳酸锂浓度为1.0～5.0g/L。在一些实施方案中，试剂R2中谷氨酸钠浓度为30.0～100.0g/L。在一个优选的实施方案中，试剂R2中Xa因子的浓度为0.05～3.0U/ml。在本专利技术的上下文中，活性单位U指的是在特定的条件下，1min能转化1μmol底物的酶量，即1U＝1μmol/min。在一些实施方案中，试剂R1中的缓冲液选自HEPES、Tris和磷酸盐缓冲液的一种或多种，优选为HEPES。在一些实施方案中，试剂R2中的缓冲液选自HEPES、Tris和磷酸盐缓冲液的一种或多种，优选为Tris。在一个优选的实施方案中，试剂R1中的缓冲液浓度为10～50g/L，且/或R2中的缓冲液浓度为10～50g/L。在本专利技术的一些实施方案中，试剂R1进一步包含表面活性剂。在一些优选实施方案中，试剂R1中的表面活性剂为聚氧乙烯十二烷基醚和聚氧乙烯烷基醚。更优选地，试剂R1中的聚氧乙烯十二烷基醚的浓度为0.5～10.0ml/L，聚氧乙烯烷基醚的浓度为0.5～10.0ml/L。在一些实施方案中，试剂R1进一步包含稳定剂、无机盐、防腐剂、和还原剂。在一些实施方案中，试剂R1中的稳定剂可以是甘露醇、山梨醇、和聚乙二醇中的一种或多种，且优选为甘露醇。在一个优选实施方案中，试剂R1中的稳定剂浓度为5.0～100.0g/L。在一些实施方案中，试剂R1中的无机盐可以是钠盐或钾盐，例如NaCl或KCl，优选为NaCl。更优选地，试剂R1中的无机盐离子浓度为1.0～30.0g/L。在一些实施方案中，试剂R1中的防腐剂可以是PC300(指防腐剂ProClin300，其主要包含2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮和5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮)、MIT(指2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮)、和叠氮化钠的一种或多种；优选为叠氮化钠。优选地，所述防腐剂浓度为0.1～10g/L。在一些实施方案中，所述还原剂可以是羟胺化合物，例如盐酸羟胺、硫酸羟胺、正丁醛、酒石酸、抗坏血酸和甲酸中的任一种或多种，优选为盐酸羟胺。更优选地，试剂R1中所述还原剂浓度为1.0～50g/L。在一些实施方案中，试剂R2进一步包含无机盐和表面活性剂。在进一步的实施方案中，试剂R2中的无机盐可以是钠盐或钾盐，例如NaCl或KCl，优选为NaCl。更优选地，所述无机盐浓度为1.0～30.0g/L。在一些的实施方案中，试剂R2中的表面活性剂可以是Tween-20。优选地，试剂R2中的表面活性剂浓度为0.5ml～5.0ml。在一些实施方案中，试剂R2进一步包含抗凝剂和防腐剂。在进一步的实施方案中，所述抗凝剂可以是除肝素外的其他抗凝剂，例如EDTA·2Na、EDTA·2K、柠檬酸钠等，优选为EDTA·2Na。在进一步的实施方案中，试剂R2中的防腐剂可以是PC300、MIT、和叠氮化钠的一种或多种；优选为叠氮化钠。优选地，试剂R2中所述抗凝剂浓度为1.0～50.0g/L，防腐剂浓度为0.1～10g/L。在一些实施方案中，R2中的甘氨酸、乳酸锂和谷氨酸钠共同用作稳定剂。在一些实施方案中，所述肝素为普通肝素或低分子肝素。优选地，所述试剂盒中R1与试剂R2的体积比为1:1。在一些实施方案中，本专利技术的肝素活性测定试剂盒包含试剂R1和试剂R2，其各自包含如下组分：在一些实施方案中，所述肝素为普通肝素或低分子肝素。在本专利技术的又一个方面，提供了一种测定肝素活性的方法，例如在药物生产过程中测定肝素活性的方法，其包括如下步骤：(a)提供待测样品及前述任一实施方案所述的肝素活性测定试剂盒；(b)将所述样品与试剂盒中的试剂R1和试剂R2混合，使其充分反应；(c)测定反应后的吸光度差值；(d)根据吸光度变化值计算样品中的肝素的活性。在一些实施方案中，步骤(b)中所述的试剂R1与试剂R2的混合体积比为1:1。在进一步的实施方案中，步骤(b)中所述的样品与试剂R1和试剂R2的总体积的体积比为1:20至1:50。在一些实施方案中，所述肝素为普通肝素或低分子肝素。在本专利技术的又一个方面，提供了将甘氨酸、乳酸锂和谷氨酸钠的组合用于提高肝素测定试剂稳定性的用途。在本专利技术的又一个方面，提供了甘氨酸、乳酸锂和谷氨酸钠的组合在制备用于测定Xa特异性抑制剂的试剂中的用途。优选地，提供本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种肝素活性测定试剂盒，其包含试剂R1和试剂R2；所述试剂R1包含发色底物及缓冲液，所述试剂R2包含甘氨酸、乳酸锂、谷氨酸钠、Xa因子(Fxa)及缓冲液。

【技术特征摘要】
1.一种肝素活性测定试剂盒，其包含试剂R1和试剂R2；所述试剂R1包含发色底物及缓冲液，所述试剂R2包含甘氨酸、乳酸锂、谷氨酸钠、Xa因子(Fxa)及缓冲液。2.如权利要求1所述的试剂盒，其中所述发色底物选自如下一项或多项：Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-pNA、Suc-Ile-Glu(γ-pip)-Gly-Arg-pNA·HCl、N-α-Z-D-Arg-Gly-Arg-pNA·2HCl、和Z-D-Arg-Gly-Arg-pNA·2HCl。3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其中所述试剂R2中甘氨酸浓度为10.0～50g/L。4.如权利要求1或2所述的试剂盒，其中所述试剂R2中乳酸锂浓度为1.0～5.0g/L。5.如权利要求1或2所述的试剂盒，其中所述试剂R2中谷氨酸钠浓度为30.0～100.0g/L。6.如权利要求1-5任...

【专利技术属性】
技术研发人员：温昶钰，王高煊，陈其云，
申请(专利权)人：迈克生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：四川,51