【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学，具体涉及一种用于pcr检测的引物探针组、试剂盒及应用。
技术介绍
1、聚合酶链式反应(pcr)是不采用活的生物体而对dna进行酶复制的分子生物学技术。pcr通常用于医学和生物研究实验室以承担多种任务，例如感染性疾病的诊断、基因克隆、实验动物表型鉴定、转录组研究、遗传疾病的检测、基因指纹的鉴定、亲子鉴定等等。由于其无可比拟的复制和精确能力，pcr被分子生物学家认为是核酸检测的首选方法。上世纪90年代后期，美国abi公司推出的实时荧光定量pcr(real time quantitative pcr，qpcr)技术及相关产品更是将pcr发展成为一种高灵敏、高特异性和精确定量的核酸序列分析技术。
2、目前在qpcr平台应用较多的引物探针设计方式主要为taqman水解探针法，其工作原理主要是利用了一条与能模板特异性结合且两端分别标记荧光基团(供体)和淬灭基团(受体)的寡核苷酸探针，同时在探针的上游和下游分别设计一条特异性pcr引物。在pcr反应开始之前，由于荧光共振能量转移(fret)原理，taqman探针一端的荧光基团发射的荧光信号被另一端的淬灭基团吸收，从而使得荧光信号不被仪器检测到；而pcr扩增开始后，taqman探针与模板特异性结合，当dna聚合酶(taq酶)在延伸到探针结合模板的位点时，其5-3’核酸外切酶活性会将taqman探针切断，使得探针上标记的荧光基团远离淬灭基团，不再形成fret结构，因此荧光基团发射的信号能够被仪器检测到。但是在同一反应体系中，要实现多重靶标的pcr检测，需要设置
3、为实现超多重的pcr检测，现有技术通常会将pcr检测技术与其它方法结合起来，例如pcr与杂交芯片结合，以不同的扩增产物长度进行多重靶标检测。如文献cn107090519a所公开的一种呼吸道常见病原体多重rt-pcr联合基因芯片检测试剂盒的方法，利用了核酸分子杂交的原理，将针对各靶标的单链探针按特定顺序排列固定于基因芯片上，形成探针阵列，再将待测的多重pcr产物与其杂交，使得靶标扩增产物与芯片上的探针杂交并发出荧光信号。该方法虽然能同时检测20种呼吸道病原体，但是基因芯片制备工艺复杂，价格昂贵，不利于临床推广开展，而且过程繁琐，需要经过多个开盖、清洗的步骤，易造成污染导致结果出现假阳性。
4、又如文献cn103074450b所公开的一种同步检测三十种腹泻致病菌的试剂盒及其检测方法，利用了pcr扩增与毛细管电泳结合的方式，将pcr扩增产物取出并进行毛细管电泳分析，将获得的图谱与标准图谱对比从而判断腹泻致病菌的种类。该方法在使用pcr扩增检测设备以外，还需要使用毛细管电泳设备进行产物分析，使得检测成本大大增加，不利于临床推广使用。
5、因此，临床急需一种能够进行多重分子检测的方法，能够快速、简便、低成本地检测多种临床常见的靶标如细菌、病毒、基因突变等，使得包括基层医院在内的临床单位能够快速的开展常见靶标的检测，如病原微生物感染检测等，辅助其它检测和确诊手段，更快速的为临床提供诊断证据和用药方案，减少患者精神负担和经济负担，达到精准医疗的目的。
技术实现思路
1、本专利技术针对现有技术中在单管反应中检测并区分多种不同靶标物的方法的不足，提供了一种用于pcr检测的引物探针组、试剂盒及应用，利用所述引物探针组或包括至少2组所述引物探针组的引物探针组合物，可实现以下至少一种分析、检测：可在单管/单一反应体系中可进行熔解温度分析，即使用同一荧光通道，通过熔解温度特征，可以检测不同的靶标物；还可进行荧光通道与熔解温度两个维度的分析，即使用同一荧光通道，通过熔解温度特征，可以检测不同的靶标物；并使用不同的荧光通道，即可实现荧光通道数量与熔解温度特征之乘积的靶标物种类检测。进一步地，本专利技术还解决了不分型检测过程中因目的基因浓度不同而带来的扩增失衡，实现均衡扩增的目的。此外，本专利技术还可有效避免扩增过程中引物二聚体(dimer)的产生。
2、为此，本专利技术第一方面提供了一种用于pcr检测的引物探针组，其特征在于，其包括1种探针(p)、至少1种第一引物和至少2种第二引物；
3、所述第一引物包含靶标序列结合区1，所述靶标序列结合区1为能够与靶标序列特异性配对结合的序列；
4、所述探针(p)为一段不与任何靶标序列配对结合的序列，其包括探针信号检测区(h)；所述探针(p)上修饰有检测基团；
5、所述至少2种第二引物彼此不同，各自独立地包含引物信号检测区(h)和靶标序列结合区2；其中，不同的所述第二引物中的靶序列结合区2为与不同靶标序列特异性配对结合的序列，不同的所述第二引物中的引物信号检测区(h)均为一段不与任何靶标序列配对结合，且与探针(p)的探针信号检测区(h)具有部分或全部相同的序列；不同的所述第二引物的引物信号检测区(h)的序列彼此不同；
6、所述第一引物和第二引物分别与靶标特异性结合后产生预扩增产物，所述预扩增产物中含有一条具有引物信号检测区(h)的反向互补序列(h’)的单链预扩增产物，所述单链预扩增产物中的反向互补序列(h’)与探针(p)特异性结合并延伸≥0个碱基后形成双链产物，所述双链产物的形成引起探针信号变化；
7、不同的所述第二引物所形成的不同单链预扩增产物，与探针(p)结合后形成的不同双链产物的tm值相近。
8、本专利技术中，tm值为熔解温度。
9、本专利技术中，所述第一引物为正向引物(f)，所述第二引物为反向引物(r)；或
10、所述第一引物为反向引物(r)，所述第二引物为正向引物(f)。
11、本专利技术中，所述引物探针组中第一引物种类数小于等于第二引物种类数。
12、本专利技术中，所述第二引物的种类数决定所述引物探针组可检测的靶标种数。
13、本专利技术中，与探针(p)所形成的双链产物的tm值相近是指不同单链预扩增产物与探针(p)所形成的双链产物的tm值相差0～4℃，优选地，相差0～2℃，更优选地，相差0～1℃。
14、本专利技术中，“不同的所述第二引物的引物信号检测区(h)的序列彼此不同”指的是不同的所述第二引物的引物信号检测区(h)的序列的碱基不同和/或长度不同，和/或，不同引物信号检测区(h)的反向互补序列(h’)与探针(p)的探针信号检测区(h)反向互补的位置不同。
15、调整所述第二引物的引物信号检测区(h)的序列的碱基和/或长度，和/或，调整引物信号检测区(h)的反向互补序列(h’)与探针(p)的探针信号检测区(h)反向互补的位置，使得含有不同引物信号检测区(h)的反向互补序列(h’)的不同单链预扩增产物与探针(p)结合形成不同的双链产物。每种第二引物的引物信号检测区(h)不能与其他第二引物的引物信号检测区(h)的反向互补序列(h’)形成完全的互补序列，减少了引物之间的竞争。
16、本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于PCR检测的引物探针组，其特征在于，其包括1种探针(P)、至少1种第一引物和至少2种第二引物；
2.根据权利要求1项所述的引物探针组，其特征在于，所述第一引物从5’端至3’端依次包含探针锚定区(A)和靶标序列结合区1；其中，所述探针锚定区(A)为一段不与任何靶标序列配对结合的序列；
3.根据权利要求2所述的引物探针组，其特征在于，所述探针(P)为1)～4)中的任意一种结构；
4.根据权利要求1-3中任一项所述的引物探针组，其特征在于，所述检测基团包括第一检测基团和第二检测基团，且所述第一检测基团和第二检测基团通过距离的变化产生信号的变化；优选地，所述第一检测基团与所述第二检测基团之间间隔3-250埃；优选地，3-201埃；更优选地，间隔3-140埃；
5.根据权利要求1-4中任一项所述的引物探针组，其特征在于，所述探针(P)的3’端含有阻断区域。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的引物探针组，其特征在于，至少1种所述第二引物的5’端含有延伸阻滞区(M)；
7.权利要求1-6中任一项所述的用于PC
8.一种用于PCR检测的试剂盒，其包括如权利要求1-6中任一项所述的用于PCR检测的引物探针组，优选地，还包括扩增试剂；进一步优选地，所述扩增试剂包括DNA聚合酶和dNTPs；更进一步优选地，当所述核酸模板为RNA时，所述扩增试剂还包括逆转录酶。
9.一种用于PCR检测的引物探针组合物，其包括至少1组如权利要求1-6中任一项所述的引物探针组。
10.根据权利要求9所述的引物探针组合物，其特征在于，至少两个不同组的所述引物探针组共用1条探针(P)，不同组的第二引物所形成的不同单链预扩增产物与探针(P)结合并延伸≥0个碱基后形成的不同双链产物的Tm值不相近。
11.根据权利要求9或10所述的引物探针组合物，其特征在于，
12.权利要求9-11中任一项所述的用于PCR检测的引物探针组合物在制备用于多种不同靶标物检测的试剂中的应用。
13.一种用于PCR检测的试剂盒，其包括如权利要求9-11中任一项所述的用于PCR检测的引物探针组合物，优选地，还包括扩增试剂；进一步优选地，所述扩增试剂包括DNA聚合酶和dNTPs；更进一步优选地，当所述核酸模板为RNA时，所述扩增试剂还包括逆转录酶。
14.一种利用如权利要求8或13所述的试剂盒对待测样本进行PCR检测的方法，其包括如下步骤：
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述步骤S4包括如下步骤：
16.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，
17.一种利用如权利要求8或13所述的试剂盒对待测样本进行PCR检测的方法，其包括如下步骤：
...【技术特征摘要】
1.一种用于pcr检测的引物探针组，其特征在于，其包括1种探针(p)、至少1种第一引物和至少2种第二引物；
2.根据权利要求1项所述的引物探针组，其特征在于，所述第一引物从5’端至3’端依次包含探针锚定区(a)和靶标序列结合区1；其中，所述探针锚定区(a)为一段不与任何靶标序列配对结合的序列；
3.根据权利要求2所述的引物探针组，其特征在于，所述探针(p)为1)～4)中的任意一种结构；
4.根据权利要求1-3中任一项所述的引物探针组，其特征在于，所述检测基团包括第一检测基团和第二检测基团，且所述第一检测基团和第二检测基团通过距离的变化产生信号的变化；优选地，所述第一检测基团与所述第二检测基团之间间隔3-250埃；优选地，3-201埃；更优选地，间隔3-140埃；
5.根据权利要求1-4中任一项所述的引物探针组，其特征在于，所述探针(p)的3’端含有阻断区域。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的引物探针组，其特征在于，至少1种所述第二引物的5’端含有延伸阻滞区(m)；
7.权利要求1-6中任一项所述的用于pcr检测的引物探针组在制备用于多种不同靶标物检测的试剂中的应用。
8.一种用于pcr检测的试剂盒，其包括如权利要求1-6中任一项所述的用于pcr检测的引物探针组，优选地，还包括扩增试剂；进一步优选地，所述扩增试剂包括dna聚合酶和dnt...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄秋萍，王海鑫，胡莞尔，
申请(专利权)人：迈克生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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