DNA结合蛋白的定量方法及定量用试剂盒技术

本发明专利技术提供一种定量液体试样中靶ＤＮＡ结合蛋白的方法及其定量试剂盒，包括以下步骤：混合第一测定用试剂和液体试样，制备第一混合液，测定第一混合液中的第一并进扩散时间；混合第二测定用试剂和液体试样，制备第二混合液，测定第二混合液中的第二并进扩散时间；根据第一并进扩散时间和第二并进扩散时间的差，定量液体试样中所含靶ＤＮＡ结合蛋白。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种DNA结合蛋白的定量方法及定量用试剂盒。
技术介绍
作为从生物试样那种含杂质的试样中定量靶DNA结合蛋白的方法， 有EP1138781公开的方法。根据此方法，对使耙DNA结合蛋白特异性结合 到探针的复合物进行分离，再用免疫学定量法或PCR法定量所得复合物。从试样分离出含有靶DNA结合蛋白和探针的复合物是一项很烦琐的 操作过程。用免疫学定量法或PCR法定量复合物中所含靶DNA结合蛋白 和DNA也同样费事。因此，运用EP1138781公开的方法获得定量结果需要 很长时间。US2006166237中提出了一个利用荧光相关光谱法仅从含有若干蛋 白质的试样中快速检测出靶DNA结合蛋白，不进行分离、洗涤操作的方 法。根据US2006166237的实施例，用荧光标记DNA探针可以检测出生物 试样的核提取物中的转录因子AP—l和NF—kB。在所用DNA结合探针与 靶转录因子的结合反应中，转录因子的浓度与所测并进扩散时间有相关 性。添加激活转录因子(AP—1)的刺激因子(TNF—a)与标记DNA探 针转录因子复合物之间也显示有相关性。荧光相关光谱法是一种测定液态试样所含分子的布朗运动所花费的 并进扩散时间的方法。根据US2006166237所述方法，通过延长探针和蛋 白质形成复合物所需的并进扩散时间，检测与探针特异性结合的蛋白质。 然而，液态试样中的分子的布朗运动易受溶液粘度的影响。在此，生物 试样往往含有大量作为杂质的蛋白质等高分子物质。因此，即使生物试样中靶蛋白质与探针的复合物数量相同，也有可能受液体试样所含高分 子物质的影响，导致所测扩散时间发生变化。另外，EP1835283公开了一种通过测定炎症细胞因子的转录因子，进 行含败血症在内的全身性炎症症候群(SIRS)的辅助诊断的方法。SIRS 每时每刻病情都在发生变化，需要根据病情实施治疗。因此，人们希望 在一小时之内能够定量作为诊断依据的靶蛋白的量。需要分离、洗涤耙 蛋白的定量方法可以用于体检那种不急的蛋白定量。而无法用于需要快 速定量采自患者的试样中所含靶蛋白量这种病情变化的诊断。因此，需 要用荧光相关光谱法等快速测定转录因子。如上所述，特别是在病情变化的诊断中，人们一直寻求一个用荧光 相关光谱法更准确地定量作为DNA结合蛋白的NF —KB和AP — 1等转录 因子的方法。
技术实现思路
本专利技术的范围只由后附权利要求书所规定，在任何程度上都不受这 一节
技术实现思路
的陈述所限。本专利技术的目的是提供一种用荧光相关光谱法准确定量诸如生物试样 等含杂质的试样中所含靶DNA结合蛋白的方法及其定量用试剂盒。艮口，本专利技术提供一种定量液体试样中的耙DNA结合蛋白的方法，包括以下步骤混合第一测定用试剂和液体试样，制备第一混合液，测定第一混合 液中的第一并进扩散时间，其中，第一测定用试剂含有荧光标记核酸探针和第一非标记核酸探针，靶DNA结合蛋白可结合到荧光标记核酸探针 和第一非标记核酸探针；混合第二测定用试剂和液体试样，制备第二混合液，测定第二混合 液中的第二并进扩散时间，其中，第二测定用试剂含有荧光标记核酸探 针和第二非标记核酸探针，靶DNA结合蛋白不能结合到第二非标记核酸 探针；及根据第一并进扩散时间和第二并进扩散时间的差，定量液体试样中 所含靶DNA结合蛋白。所述定量步骤是根据第一并进扩散时间和第二并进扩散时间的差以及表示靶DNA结合蛋白量与并进扩散时间关系的数据定量液体试样中 所含靶DNA结合蛋白的。所述表示靶DNA结合蛋白量与并进扩散时间关系的数据是校准曲 线，通过用荧光相关光谱法测定混合含荧光标记核酸探针的溶液和含一 定量靶DNA结合蛋白的溶液制备的混合液中的并进扩散时间而获得。第一测定用试剂所含第一非标记核酸探针的量比第一测定用试剂所 含荧光标记核酸探针的量多；第二测定用试剂所含第二非标记核酸探针 的量比第二测定用试剂所含荧光标记核酸探针的量多。第一测定用试剂所含第一非标记核酸探针的浓度与第二测定用试剂 所含第二非标记核酸探针的浓度相同。所述液体试样含核提取物。靶DNA结合蛋白为转录因子。转录因子是细胞因子的转录因子。荧光标记核酸探针的核酸序列与第一非标记核酸探针的核酸序列相同。荧光标记核酸探针、第一非标记核酸探针和第二非标记核酸探针的 至少一个形成茎环结构。本专利技术还提供一种用荧光相关光谱法定量液体试样中耙DNA结合蛋 白的试剂盒，包括含有荧光标记核酸探针和第一非标记核酸探针的第一测定用试剂；及含有荧光标记核酸探针和第二非标记核酸探针的第二测定用试剂；其中，靶DNA结合蛋白可与荧光标记核酸探针和第一非标记核酸探针结合，不能与第二非标记核酸探针结合。所述试剂盒中第一测定用试剂所含第一非标记核酸探针的量比第一 测定用试剂所含荧光标记核酸探针多，第二测定用试剂所含第二非标记 核酸探针的量比第二测定用试剂所含荧光标记核酸探针的量多。所述试剂盒中第一测定用试剂所含第一非标记核酸探针的浓度与第二测定用试剂所含第二非标记核酸探针的浓度相同。所述试剂盒中荧光标记核酸探针的核酸序列与第一非标记核酸探针 的核酸序列相同。所述试剂盒中荧光标记核酸探针、第一非标记核酸探针和第二非标 记核酸探针的至少一个形成茎环结构。 所述液体试样含核提取物。所述靶DNA结合蛋白为转录因子。 所述转录因子为细胞因子的转录因子。使用本专利技术的定量方法和定量用试剂盒，不必进行分离、提炼耙DNA 结合蛋白等烦琐的操作，就可以快速、准确地定量耙DNA结合蛋白。因 此，本专利技术的定量方法和定量用试剂盒可适用于病情变化的诊断。 附图说明为表示NF—KB与并进扩散时间关系的校准曲线图。为用纯液体试样时的FCS测定结果一览图。为核提取物试样中NF—KB的FCS测定结果一览图。具体实施例方式首先就在本专利技术的DNA结合蛋白定量方法中使用的定量用试剂盒进 行说明。本专利技术的DNA结合蛋白定量用试剂盒适用于运用荧光相关光谱法的 测定。定量用试剂盒包含第一测定用试剂和第二测定用试剂。第一测定用试剂含有荧光标记核酸探针(PfW)和第一非标记核酸探 针(Pw)。靶DNA结合蛋白可以分别结合到荧光标记核酸探针(P&) 和第一非标记核酸探针(Pw)各自的核酸序列。第二测定用试剂含有荧光标记核酸探针(Pfw)和第二非标记核酸探 针(Pn)。在此，靶DNA结合蛋白不能结合到第二非标记核酸探针(Pn) 核酸序列。即，第二测定用试剂包括具有能与靶DNA结合蛋白结合的核 酸序列的荧光标记核酸探针(Pb)和有不与靶DNA结合蛋白结合的核酸 序列的非标记核酸探针(Pn)。所谓DNA结合蛋白是对DNA有亲和性、与DNA特异性或非特异性结 合的蛋白质的总称。比如有与双链DNA结合的蛋白质、与单链DNA结 合的蛋白质、参与保持染色体高层次结构的蛋白质、DNA依赖型ATP酶 和DNA拓扑异构酶等。作为本专利技术测定目标的靶DNA结合蛋白以与双链 DNA特异性结合的DNA结合蛋白为宜，调节基因表达的DNA结合蛋白尤 佳。更具体地说，作为靶DNA结合蛋白可以举出转录因子等。作为转录 因子最好是调节细胞因子转录的转录因子。作为细胞因子的转录因子有 NF—kB、 AP — 1、 NFAT、 STAT家族、IRF家族、C/EBP、 Spl和CREB 等。其本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种定量液体试样中的靶ＤＮＡ结合蛋白的方法，包括以下步骤：　混合第一测定用试剂和液体试样，制备第一混合液，测定第一混合液中的第一并进扩散时间，其中，第一测定用试剂含有荧光标记核酸探针和第一非标记核酸探针，靶ＤＮＡ结合蛋白可结合到荧光标记核酸探针和第一非标记核酸探针；　混合第二测定用试剂和液体试样，制备第二混合液，测定第二混合液中的第二并进扩散时间，其中，第二测定用试剂含有荧光标记核酸探针和第二非标记核酸探针，靶ＤＮＡ结合蛋白不能结合到第二非标记核酸探针；及　根据第一并进扩散时间和第二并进扩散时间的差，定量液体试样中所含靶ＤＮＡ结合蛋白。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：山形浩一，阿部滋树，
申请(专利权)人：希森美康株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]