Ⅳ型胶原蛋白化学发光免疫分析定量测定试剂盒及其制备方法技术

本发明专利技术涉及免疫分析医学领域，具体地，本发明专利技术提供了一种肝纤维化程度相关Ⅳ型胶原蛋白化学发光免疫分析定量测定试剂盒及其制备方法。根据本发明专利技术试剂盒包括：１）Ⅳ型胶原蛋白校准品；２）亲和素包被的固相载体；３）Ⅳ型胶原蛋白的抗体酶标记物；４）生物素化的Ⅳ型胶原蛋白的抗体；５）化学发光底物；以及６）浓缩洗涤液。进一步，根据本发明专利技术制备上述试剂盒的方法包括以下步骤：１）以Ⅳ型胶原蛋白纯品配制校准品；２）以亲和素包被固相载体；３）以酶标记Ⅳ型胶原蛋白的抗体；４）使Ⅳ型胶原蛋白的抗体生物素化；５）配制化学发光底物；６）配制浓缩洗涤液；７）分装上述校准品、标记物和化学发光底物和洗涤液；以及６）组装为成品。本发明专利技术的试剂盒具有简便、快速、灵敏、稳定等优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及免疫分析医学领域，具体地，本专利技术提供了一种肝纤维化早期的检测指标IV胶原蛋白化学发光免疫分析定量测定试剂盒及其制备方法。
技术介绍
肝脏是人体消化系统中最大的消化腺，又是新陈代谢的重要器官。肝纤维化 是指肝脏纤维结缔组织的过度沉积，是纤维增生和纤维分解不平衡的结果，各种 原因引起的肝细胞脂肪变、淤胆及炎症等，达到一定严重程度均可刺激肝内局部的 贮脂细胞、静止的纤维母细胞增生并形成胶原纤维，增多的纤维组织形成细小的 条索和菲薄的间隔，使肝脏纤维化变导致肝功能受损的综合症。肝纤维化是肝硬 化的早期阶段，对它早期诊断、及时抗纤维化治疗，对肝硬化的防治、延缓、逆 转等都起到极大的作用。随着肝纤维化研究的深入，不断地揭示了胶原结构、功能与病理学的内在关系。尤其对IV型胶原蛋白(英文縮写CL-IV)的研究更加深入，在肝纤化的早期 诊断上更有价值，因此检测血液中的IV胶原蛋白的含量对肝纤维化的诊断、治疗 效果和愈后的判断具有重要意义。到目前为止，经肝穿刺或经腹腔镜肝活检，进 行组织病理学检查仍是诊断肝纤维化和肝硬化的"金标准。但是肝活检技术也有其 局限性，因为慢性肝炎等病变虽然是弥漫性的，但很难保证一次取材能反映整个 肝脏的全貌，尤其是肝纤维化和肝硬化时细针负压肝穿刺难以获得足够的标本给 诊断带来一定的困难。目前，肝纤维化的血清学检测指标IV型胶原蛋白的检测方法主要有放免法和 酶联免疫法。放射免疫分析法操作复杂、测定结果不稳定、试剂保存时间短、放 射性污染、仪器昂贵等问题；而酶联免疫分析法灵敏度低，线性范围窄等缺点。化学发光免疫分析法是一种较先进而有效的方法，是在抗原-抗体特异性识别 基础上建立起来的一种新的非放射免疫分析技术--化学发光免疫分析技术，由于这 种方法具有灵敏度高，特异性强，精密度好，线性范围宽，仪器设备简单，试剂 价格低廉，方法稳定、快速等优点，更易推广应用。
技术实现思路
本专利技术的目的正是为了克服上述已有技术上的缺点与不足，采用抗人IV型胶 原蛋白单抗包被微孔板的一种双抗体夹心一步法测定人血清中IV型胶原蛋白含量 的抗人IV型胶原蛋白化学发光定量测定试剂盒，其特点是操作简便、快速、灵敏、稳定，可迅速、准确的判断和监控病程。本专利技术提供了一种肝纤维化的指标IV型胶原蛋白(CL-IV)化学发光免疫分 析定量测定试剂盒及其制备的方法。根据本专利技术试剂盒包括1) IV型胶原蛋白校准品；2) 已包被亲和素的固相载体；3) 酶标记的IV型胶原蛋白的单抗或多抗；4) 生物素化的IV型胶原蛋白的单抗或多抗；以及5) 上述酶所作用的化学发光底物；6) 浓縮洗涤液。根据本专利技术的试剂盒，其中，所述固相载体为微孔板、塑料珠、塑料管 或磁性颗粒。根据本专利技术的试剂盒，其中，所述标记酶为碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。根据本专利技术的试剂盒，其中，所述化学发光底物为1，2-二氧乙烷类衍生 物、鲁米诺或异鲁米诺。优选地，上述试剂盒中，所述1，2-二氧乙垸类衍生物为(金刚烷)-1，2-二 氧乙垸、3-(2'-螺旋金刚垸)-4-甲氧基-4-(3"-磷酰氧基)苯基-l， 2-二氧乙烷、 CSPD或CDP- Star。进一步，本专利技术提供了一种制备上述试剂盒的方法，包括以下步骤1) 以IV型胶原蛋白纯品配制校准品；2) 以亲和素包被固相载体；3) 以酶标记IV型胶原蛋白的单抗或多抗；4) 使IV型胶原蛋白的单抗或多抗生物素化；5) 配制化学发光底物；6) 配制浓縮洗涤液；7) 分装上述IV型胶原蛋白的校准品、生物素化的IV型胶原蛋白单抗或多抗、 酶标记的IV型胶原蛋白的抗体、该酶所作用的化学发光底物和浓縮洗涤液；以及8) 组装为成品。在根据本专利技术的方法中，其中所述包被固相载体的步骤2)包括以下方法用0.050MpH值为9.6的碳酸盐缓冲液配制成所需浓度的亲和素包被液，并将 包被液负载于固相载体上；经生理盐水洗涤、BSA封闭，抽湿干燥后用铝箔袋密 封。当IV型胶原蛋白的单抗或多抗酶标记物为辣根过氧化物酶时，采用过碘酸 钠法进行标记，其具体原理为辣根过氧化物酶为一种分子量为44,000的糖蛋 白，含糖量达到18%。本专利技术使用过碘酸钠氧化与酶活性无关的糖基，生成的 醛基与抗体上的氨基形成Sciff's碱，接着加入硼氢化钠将其还原成稳定的结合物， 最后往加入酶标记抗体中加入等量的甘油进行保存。当IV型胶原蛋白的单抗或多抗酶标记物为碱性磷酸酶标记时，采用戊二醛 法联接。具体的上述包被方法剂盒可以包括IV型胶原蛋白校准品、亲和素包被板、生 物素化的抗体、酶标记物与化学发光底物液、20倍浓縮洗涤液等。其中，所述IV 型胶原蛋白校准品为标准级，纯度不低于90%、亲和素包被板为48或96孔的微 孔板条、过氧化物酶标记IV型胶原蛋白单抗或多抗、生物素标记IV型胶原蛋白 单抗或多抗、化学发光底物液为鲁米诺、浓縮洗漆液为Tris-HCl。本专利技术"IV型胶原蛋白化学发光免疫分析定量测定试剂盒"可定量检测IV型 胶原蛋白的含量，根据IV型胶原蛋白含量的多少对肝纤维化、糖尿病和矽肺等疾 病的诊断及其病程的进行监控。它具有简便、快速、灵敏、稳定等优点。本专利技术"IV型胶原蛋白化学发光免疫分析定量测定试剂盒"的各项指标均达 到或优于酶联免疫分析法。本专利技术的检测系统为开放式操作，简便快速，不需要 昂贵的全自动化学发光测量仪，特别适合广大的中小医院推广使用，为临床诊断 和科研工作提供一种非常有价值的检测手段。根据本专利技术的试剂盒，酶标记的IV 型胶原蛋白单抗与载体上包被的IV型胶原蛋白单抗或多抗和被测样品的IV型胶原蛋白抗原形成"双抗体夹心"结构，因此本专利技术采用的"双抗体夹心一步法" 反应模式，既有效地利用了化学发光技术原理、又确保了检测的灵敏性。另外， 这种模式还便于操作和生产。本专利技术的试剂盒应用的是酶催化发光底物，通过检测发光底物产生的光信号 代替酶联免疫分析中的显色底物，因而具有与酶联免疫分析同等的特异性，而灵 敏度比现今的酶联免疫吸附分析灵敏度大大提高，可为肝纤维化早期诊断提供更 为特异、快速、可靠的依据。附图说明图1为本专利技术的iv胶原蛋白定量测定试剂盒临界值的确定。图2为实施例1所制备的试剂盒中的校准品线性图。 图3本专利技术试剂盒和酶联免疫试剂盒相关性。 具体实施例方式实施例l制备本专利技术的IV型胶原蛋白定量测定试剂盒一、酶标抗体制备和生物素偶联抗体的制备1、 辣根过氧化物酶标记iv型胶原蛋白抗体的制备溶解4.4mg HRP于lmL蒸馏水中，加入0.4mL过碘酸钠(5Ommol/L)室温 搅拌20min，经lmmol/L醋酸钠缓冲液，pH值为4.4透析后加入8mglV型胶原蛋 白单抗，搅拌2h，最后用200mmol/L NaBH4进行还原，经0.02MPB缓冲液透析 后，加等体积甘油，一20'C以下保存。2、 生物素偶联IV型胶原蛋白抗体的制备(1) 用常规方法将生物素(BNHS)溶于N， N—二甲基甲酰胺(DMF)配 成lmg/mL',(2) 用0.1mol/LpH值为9.0的NaHC03将纯化的IV型胶原蛋白抗体稀释为 1 2mg/mL;(3) 按BNHS与抗体容积比为1: 8或重量比h 7左右混合，室温搅拌下反 应2 4h;(4) 装入透析对0.05mol/本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗人Ⅳ型胶原蛋白定量测定试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：　１）Ⅳ型胶原蛋白校准品；　２）亲和素包被的固相载体；　３）酶标记的Ⅳ型胶原蛋白单抗或多抗；　４）生物素化的Ⅳ型胶原蛋白单抗或多抗；　５）上述酶所作用的化学发光底物；以及　６）浓缩洗涤液。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：车景辉，应希堂，宋胜利，唐宝军，于尚永，
申请(专利权)人：北京科美东雅生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]